Хроматин ИммунопрецитатА Ассасси использованием микрококковой nucleases в клетках млекопитающих

В этом протоколе мы можем определить взаимодействия между белками и ДНК, раскрывая транскрипционные регуляции гена. Это помогает понять молекулярные механизмы в клетках. Мы изменяем уже существующие протоколы, а затем устанавливаем простые и четкие протоколы анализа.

Вы просто следовать протоколу с первого шага, так что анализ может быть сделано успешно. Чтобы подготовить перекрестный хроматин, в дым капот, добавить четыре миллилитров 1%VCaP клеточной культуры средств массовой информации и 0,229 миллилитров 18,5%PFA в шесть сантиметров блюдо. Аккуратно закружить блюдо, чтобы равномерно распределить PFA.

Инкубировать при комнатной температуре ровно 10 минут. Затем добавьте в блюдо 0,47 миллилитров 1,25-молярного глицинового раствора и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы остановить дальнейшее скрещивание. После мытья клеток в соответствии с рукописью, соскребать клетки и передать клеточной подвески в 1,5-миллилитровый микроцентрифуг трубки.

Центрифуга трубки с клеточной подвеской в 3000 раз г в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы восстановить гранулы клетки. Используйте пипетки, чтобы полностью удалить PBS. Завехайте номер ячейки на трубку и храните гранулы при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Для выполнения клеточного лиза сначала оттаивают хранящиеся на льду клеточные гранулы VCaP. Добавьте 300 микролитров подготовленного буфера лиза клеток ChIP, дополненного PIC, к каждой трубке и тщательно перезаполните гранулы. Вихрь трубки в течение 15 секунд, и инкубировать подвеску на льду в течение 10 минут.

Центрифуга при 9000 раз г в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. Удалите супернатант полностью, и добавить 300 микролитров буфера пищеварения MNase для повторного перерасхода гранул. Разбавить MNase с буфером пищеварения MNase в 1,5-миллилитровой трубке, чтобы дать 50 единиц геля на микролитр.

Добавить разбавленный MNase к подвеске, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение ровно 10 минут. Установите смешивания инверсии каждые 2 1 / 2 минуты. Чтобы прекратить пищеварение MNase, добавьте 30 микролитров 0,5-молярной ЭДТА при рН восемь, и вихрь кратко.

После инкубации в течение пяти минут на льду центрифуга при 9000 раз г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Удалите супернатант полностью, и повторно гранулы в 300 микролитров подготовленного буфера разбавления ChIP дополняется PIC. Затем, на sonicator оснащен микротип зонд, установить условия звуковой амплитуды два, обработанное время 15 секунд, пульс на пять секунд, и пульс OFF 30 секунд.

Sonicate подвески на льду. Нарисуйте один микролитер подвески, и пятно на слайд-стекло. Под микроскопом, наблюдать, чтобы убедиться, что структура клетки почти сломана.

Центрифуга трубки при 9000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, и передать супернатант в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Сохранить 20 микролитров переваренного хроматина в 1,5-миллилитровой винтовой трубки для дальнейшего лечения, и хранить остаток при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Во-первых, в каждую 1,5-миллилитровую винтовую трубку добавьте 75 микролитров воды, четыре микролитера пятимолярного хлорида натрия и один микролитр протеиназы K.To удалите скрещивание между белком и ДНК, добавьте 20 микролитров переваренного хроматина из каждого состояния пищеварения MNase в винтовую трубку.

Закрыть крышку плотно, полностью перемешать, и инкубировать трубку при 65 градусов по Цельсию на ночь. Утром, после центрифугирования трубки при 2-3000 раз г в течение нескольких секунд, добавьте 100 микролитров PCI. Вихрь энергично формирует эмульсию.

Центрифуга трубки снова на максимальной скорости в течение 30 секунд при комнатной температуре. Затем приготовьте две 1,5-миллилитровые микроцентрифуговые трубки на одно состояние. Добавьте 100 микролитров PCI в одну трубку.

Добавьте 10 микролитров трехмолярного ацетата натрия при рН 5,2 и два микролитера гликогена в другую трубку. Из трубки, взятой из центрифуги, тщательно нарисуйте верхнюю фазу, содержащую ДНК, и добавьте ее в трубку, содержащую PCI. Вихрь энергично, и центрифуга трубки на максимальной скорости в течение 30 секунд при комнатной температуре.

Затем перенесите верхнюю фазу в трубку, содержащую ацетат натрия и гликоген, подготовленные ранее. Добавьте 250 микролитров этанола и перемешайте с помощью инверсии. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.

Центрифуга трубки на максимальной скорости в течение 30 минут при четырех градусах цельсия. Подтвердите гранулы на дне трубки. Аккуратно удалите супернатант, чтобы не нарушить гранулы, и добавьте 500 микролитров 70% этанола.

Центрифуга трубки на максимальной скорости в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Удалите супернатант полностью, и высушить гранулы в течение примерно пяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте 20 микролитров TE, чтобы растворить гранулы.

Измерьте концентрацию ДНК с помощью УФ-спектрофотометра. После приготовления переваренного хроматина оттаивают все образцы на льду. Добавьте 1200 микролитров подготовленного буфера разбавления ChIP, дополненного PIC, чтобы разбавить переваренный хроматин до концентрации пяти микрограммов на 500 микролитров.

Добавьте пять микролитров разбавленного переваренного хроматина в 1,5-миллилитровую винтовую трубку в качестве входного образца. Храните образец при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Добавьте 500 микролитров каждый из разбавленного переваренного хроматина в 1,5-миллилитровую винтовую трубку в качестве образца иммунопреципиентации.

Добавьте два микрограмма антител к каждой трубке и закройте крышку. Инкубировать трубки при четырех градусах по Цельсию на ночь с нежно смешивания на качалки платформы. Утром добавьте в каждую трубку 30 микролитров магнитного шарика chIP-класса G.

Инкубировать трубки снова при четырех градусах по Цельсию в течение двух часов с нежным смешивания. После этого, спина вниз трубку кратко от двух до 3000 раз г, и поместите трубку в полиэтиленовый стойку, содержащую неодим магниты в течение одной минуты. Затем осторожно удалите супернатант стремлением.

Далее добавьте 0,5 миллилитров низкосоленого иммунного комплекса для мытья буфера к каждой трубке. Кратко вихрь трубки для разгона бисера. Инкубировать трубку при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут с нежным смешивания на качалке платформы.

Повторите стирку с высокосолевым иммунным комплексом и литиевым хлоридом иммунного комплекса в соответствии с рукописью. После полного удаления оставшегося супернатанта добавьте в трубку 150 микролитров буфера elution. Вихрь трубки, чтобы разогнать бисер полностью.

Закройте крышку и инкубировать трубку при 65 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Чтобы разогнать бисер тщательно, смешать инверсией каждые пять минут. Во время инкубации приготовьте 1,5-миллилитровую винтовую трубку и добавьте шесть микролитров пятимязыка хлорида натрия и два микролитров протеиназы K.Thaw 1% входного образца, ранее подготовленного на льду.

Добавьте в образец входного сигнала 150 микролитров буфера элюции, шесть микролитров пятимолярного хлорида натрия и два микролитера протеиназы K. После инкубации трубки, содержащей бисер, спина вниз. Поместите трубку в магнитную стойку на одну минуту и перенесите супернатант в винтовую трубку, содержащую хлорид натрия и протеиназу K.Representative микрофотографии перекрестных клеточных гранул до и после звуковой линии, которые показывают явные различия.

Без sonication, структура клетки остает неповрежденной, показывая что хроматин присутствует в ядрах. Краткая звуковая данные нарушает структуру клетки. Перекрестный хроматин был подготовлен из клеток VCaP и усваивается с различным количеством MNase.

Без добавления MNase появился мазок с очень высоким молекулярным весом. Добавление MNase дал лестницы шаблон, который показывает, что MNase переваривает интернуклеосомы. Только состояние, которое произвело фрагменты хроматина до 900 bp можно считать правильное пищеварение, в то время как неподходящий шаблон пищеварения показывает переваривание в основном привело к мононуклеосомы производства.

Шаблон пищеварения хроматина в клетках VCaP указывает на правильное переваривание хроматина. Самая высокая заполняемость H3K4methyl3 была отмечена около 0,5 килобазы и одной килобазы вверх по течению от AR-TSS. Регионы, расположенные на 19 килобазе и восемь кб вверх по течению и 12 килобазы вниз по течению от AR-TSS, однако, было мало заполняемости H3K4methyl3, что свидетельствует о том, что они могут быть использованы в качестве отрицательных регионов.

Определение состояния пищеварения MNase является наиболее важным. Поддерживайте количество клеток, объем буфера и количество ферментов в каждом эксперименте. Условие должно быть определено для каждого типа ячейки.

Мы можем выполнять секвенирование ChIP для глобальной занятости факторов и конформации хроматина для определения взаимодействий между дистальных геномных поражений. Этот метод может выявить механизмы процесса транскрипции. Анализ ChIP является мощным инструментом для изучения транскрипционные регулирования, но это громоздкий и не воспроизводиться.

Наш метод поощряет исследователей проводить анализ регулярно и легко.