Ионообменной хроматографии (IEX) в сочетании с мульти-угол рассеяния света (MALS) для разделения белков и характеристика
5 апреля 2019 г.
Этот протокол описывает использование высокой специфичности ионообменная хроматография с мульти-угол рассеяния света для точного определения молярной массы белков, белковых комплексов и пептидов в гетерогенной пробе. Этот метод является ценным для оценки качества, а также как характеристика родной олигомеров, заряд вариантов и образцы смешанные протеина.
Этот протокол представляет ионно-обмен MALs, новый метод контроля качества белка и характеристики, контроль качества, который имеет важное значение для согласованности и целостности результатов в исследованиях науки о жизни и разработки фармацевтических продуктов. Ионно-обмен MALS определяет чистоту белка, олигомерное состояние, однородность, идентичность, конформацию, структуру, пост-перевод изменений и другие свойства. Измерения неразрушаются и проводятся в растворе в почти физиологических буферных условиях.
Этот метод точно определяет молярную массу белков или пептидов, олигомерное состояние и степень спряжения, например, гликопротеинов. Он также может быть применен к мембранным белкам. IEX отделяет макромолекулы по их поверхности заряда.
Обмен анионом, AIEX и катионная биржа, CIEX, матрицы связывают отрицательно и положительно заряженные варианты соответственно. При тонком разделении белковых популяций, которые имеют относительно тесную массу или форму, IEX-MALS успешно определяет молярную массу каждого отдельного состояния белка в образце смеси. Для начала используйте 0,1-микрометровый фильтр для фильтрации всех реагентов, включая буферы для стирки и элауции.
Фильтр первых 50 до 100 миллилитров буфера в бутылку отходов для того, чтобы устранить частицы из сухих фильтров. В чистой, стерильной бутылке, которая была тщательно промыта фильтрованной водой и ограничена, чтобы предотвратить проникновение пыли, фильтруем оставшуюся часть буфера. С буфером pH-eight Tris и 50-миллимолярным хлоридом натрия разбавляйте образец BSA до шести миллиграммов на миллилитр, поэтому рН и ионная прочность позволят связываться с ионно-обменной колонкой.
Используйте шприц, чтобы ввести по крайней мере от 0,3 до 0,5 миллиграммов BSA в одноми миллилитровую колонку для достижения хорошего качества malS анализа. Для начала эксперимента по обмену ионом MALS откройте New, Experiment from Method в программном обеспечении MALS, а также выберите онлайн-метод из папки методов Light Scattering System. Если модуль DLS доступен и данные DLS должны быть приобретены, выберите онлайн-метод из рассеяния света, с субфолдером QELS.
Для настройки параметров в разделе Конфигурация сначала установите скорость потока бега в разделе Generic Pump на скорость потока, используемую в FPLC, как 1,5 миллилитров в минуту. В разделе Solvent введите или пройдите проверку параметров буфера. В разделе Инжектор введите название белка как BSA, рефракционный индекс увеличивается на 0,185 миллилитров на грамм, а коэффициент уф-вымирания на длине волны 280 нанометров составляет 0,66 литра на грамм сантиметра.
Во вкладке Пример введите концентрацию образца белка в шесть миллиграммов на миллилитр, а затем вставьте объем образца для инъекций в качестве 170 микролитров. В разделе Процедуры во вкладке «Основная коллекция» выберите триггер флажка на Auto-Inject и установите продолжительность запуска до 70 миллилитров, чтобы сбор данных продолжался в течение по крайней мере пяти минут после того, как градиент достиг своего конечного значения. Затем, в программном обеспечении FPLC, создайте новый эксперимент во вкладке Редактор метода.
Для первоначального эксперимента создайте линейный градиент соли или рН, в то время как для оптимизированного метода создайте более специфический градиент или пошаговую программу согласно рукописи. Включите импульсный сигнал в метод, который вызовет сбор данных в программном обеспечении MALS. Затем откройте насосный клапан и промойте 0,5-молярным гидроксидом натрия, чтобы удалить сильно связанные примеси, а затем нейтрализовать буферную стирку.
Затем вымойте столбец буфером Tris pH eight, клапаном A с буфером для мытья и клапаном B с буфером elution. Используйте буфер для мытья с низкой концентрацией соли в качестве окончательной стирки для полоскания колонны, чтобы обеспечить привязку белка к матрице колонки. Перед инъекцией образца, после мытья, и в конце элюции, светоизбрасывающий базовый уровень должен быть стабилизирован, чтобы обеспечить низкий уровень шума и полностью чистое разбавление.
Используя шприц, поместите образец белка в петлю. Начните эксперимент сначала в программном обеспечении MALS, нажав на кнопку Run, а затем в программном обеспечении FPLC. Данные будут собираться после получения импульсного сигнала от прибора FPLC через детектор MALS.
Если ионно-обмены MALS выполняются вручную в режиме непрерывного потока вместо автономного метода, примените те же параметры запуска и инструкции, что и ранее описанные. После проверки и запуска окончательного метода выполните точно такой же метод, используя пустую инъекцию, загрузив буфер вместо образца. Важно, чтобы время между импульсом автоматического впрыска и градиентом пустого запуска было идентично времени запуска образца.
Для начала анализа, в разделе Процедуры в программном обеспечении MALS, используйте вкладку Despiking и нормальный уровень, чтобы сгладить хроматограммы. Если они проявляют много шума, установить уровень тяжелых. В базовом представлении определите базовый уровень для всех сигналов, включая детекторы LS, UV и RI.
В представлении Пики определите пики для анализа. Прояви правильные значения прироста RI dn/dc и коэффициента уф-вымирания для белка под каждым пиком. Под моларной массой и радиусом от света рассеяния зрения, анализировать молярной массы и радиуса с помощью модели Зимм и подходят степени нуля.
Если имеется в наличии еЛС, под видом Rh с точки зрения КУЕЛС, соблюдайте значения Rh и качество соответствия функции корреляции. Сигнал RI значительно меняется во время ионно-обменного MALS запуска из-за увеличения концентрации соли. Чтобы вычесть базовый сигнал из пустой инъекции, откройте как белок, так и пустой ионный обмен MALS экспериментов.
Нажмите правой кнопкой мыши на название белкового эксперимента, выберите метод применения и выберите папку «Базовое вычитание» из диалога файлов. Выберите онлайн-метод для стандартного анализа молярной массы. В соответствии с базовым представлением вычитания нажмите Import Blank, чтобы импортировать сигналы пустого запуска.
В соответствии с инструментами, проверить все детекторы вычесть. Для калибровки ионно-обменной системы MALS с мономером BSA, под процедурами и представлением конфигурации, выравнивайте пики. В представлении о нормализации введите 3,0 нанометров в качестве значения Rg для выполнения нормализации.
Затем, под band Broadening в той же вкладке Конфигурация, выберите пик и используйте кнопку Perform Fit, чтобы соответствовать УФ-сигналам и сигналам LS к сигналу RI. График результатов отображается в представлении Results Fitting. Измените весы оси и другие параметры графика, нажав правой кнопкой на графике, выбрав Редактировать, а затем нажав на кнопку Advanced.
Чтобы иметь больше вариантов отображения, выберите вкладку EASI Graph, а в верхней части окна в меню высадки дисплея выберите Molar Mass или Rh.Все результаты, включая молярную массу, радиус, уровень чистоты и другие доступны в представлении Отчета в разделе Результаты. Используйте кнопку «Дизайнер отчетов», чтобы добавить в отчет больше результатов или параметров, а также цифры. В этом эксперименте BSA была проанализирована на ионно-обмене MALS с помощью аналитической колонки обмена анионом.
Хроматограммы отображали УФ на 280 нанометров, рассеяние света под углом 90 градусов, рефракционный индекс и кривые проводимости вместе с молярной массой каждого пика. Широкий линейный градиент, состоящий из 30 объемов столбца от 75-миллимоляра до 350-миллимолярского хлорида натрия, отделил мономеры BSA от димеров и высших олигомеров. Анализ MALS ниже по течению привел к расчетной мономерной молярной массе 66,8 килодалтонов и рассчитанной более тусклой молярной массе 130 килодальтонов.
Основываясь на проводимости буфера на элективных пиках, градиент был изменен на другую программу, длинный шаг 175-миллимолярского хлорида натрия, за которым последовал линейный градиент от 175-миллимолярского до 500-миллимолярского хлорида натрия. Новый градиент значительно улучшил разрешение и произвел отличное разделение между мономером BSA и высшими олигомерными видами. Пошаговая программа 200-миллимолярского и 250-миллимолярского хлорида натрия была применена, чтобы сосредоточиться также на высоких олигомерных видах.
Это привело к отличному разделению между мономером BSA, димером и тримером. Следуя этой процедуре, такие методы, как масс-спектрометрия, SDS-PAGE деятельности и стабильности тесты могут быть выполнены на каждом варианте разделены ионный обмен для выявления и дальнейшей характеристики каждого из них. Мы обнаружили, что ионный обмен MALS расширяет полномочия malS-анализа на образцы, которые не могут быть полностью проанализированы SEC-MALS.
Разделение по обвинению решить различные виды, которые coelute в SEC.
Обзор
В данном протоколе представлен метод ионообменной хроматографии с многоугловым светорассеянием (IEX-MALS) для точного определения молярной массы белков и пептидов. Этот метод имеет важное значение для контроля качества и характеризации в биомедицинских исследованиях и фармацевтической разработке.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Анализ белков
- Фармацевтическая разработка
Теоретическая часть
- IEX-MALS представляет собой новый метод оценки качества белков.
- Он позволяет определять различные свойства, такие как чистота и олигомерное состояние.
- Данный метод является неразрушающим и проводится в физиологических условиях.
- Он может быть использован для анализа сложных смесей белков и пептидов.
Цель исследования
- Обеспечить надежный метод определения характеристик белков.
- Обеспечить согласованность и достоверность результатов исследований.
- Облегчить анализ гликопротеинов и мембранных белков.
Используемые методы
- Ионообменная хроматография разделяет белки на основе их поверхностного заряда.
- Многоугловое светорассеяние позволяет измерить молярную массу в растворе.
- Экспериментальная установка включает фильтрацию реагентов и приготовление буферов.
- Сбор данных подразумевает использование определенных конфигураций программного обеспечения для анализа.
Основные результаты
- Метод позволяет точно определить молярную массу и олигомерное состояние.
- Он эффективно разделяет популяции белков со сходными характеристиками.
- Стабилизация базовой линии имеет решающее значение для получения достоверных данных.
- Результаты можно анализировать для изучения различных свойств белков.
Выводы
- IEX-MALS является ценным инструментом для характеристики белков.
- Данный метод повышает качество контроля в биофармацевтике.
- Он позволяет получить сведения о структуре и модификациях белков.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Ионообменная хроматография в сочетании с многоугловым светорассеянием (IEX-MALS) позволяет осуществлять точное разделение и определение молярной массы вариантов белков, которые совместно элюируются при использовании методов эксклюзионной хроматографии, что восполняет критический пробел в контроле качества биофармацевтических препаратов. Благодаря разделению олигомерных форм на основе поверхностного заряда, IEX-MALS способствует механистическому снижению рисков при разработке терапевтических белков и повышает прогностическую достоверность при ранней оценке пригодности к разработке (developability). Данный метод представляет трансляционную ценность, предоставляя ортогональные данные о чистоте, гомогенности и посттрансляционных модификациях в условиях, близких к физиологическим, что напрямую влияет на выбор ведущего кандидата и стратегию разработки состава препарата.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать олигомерные состояния белков и варианты их заряда для выяснения взаимосвязи между структурой и функцией при валидации мишени.
- Практическая ценность: обеспечивает получение количественных данных о молярной массе отдельных видов белков в смесях, что способствует проведению скрининговых кампаний на основе выдвинутых гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает разделение популяций белков с близкой массой или размером до базовой линии, что позволяет точно количественно определить мономеры, димеры и олигомеры более высокого порядка.
- Практическая ценность: позволяет получать воспроизводимые профили разделения на основе заряда, совместимые с автоматизированными системами FPLC для высокопроизводительного анализа вариантов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Позволяет оценить гомогенность белка и статус конъюгации (например, гликопротеинов) в условиях раствора, сохраняющих нативную конформацию, что важно для оценки возможности доклинической разработки.
- Практическая ценность: Обеспечивает получение ортогональных данных, дополняющих результаты SEC-MALS, что повышает уверенность в воспроизводимости партий в процессе разработки технологического процесса.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Метод IEX-MALS вписывается в континуум от открытия до доклинических исследований в качестве инструмента характеристики, который применяется после первичной экспрессии и очистки, что позволяет принимать обоснованные решения перед переходом к оптимизации ведущих соединений или исследованиям по разработке лекарственной формы.
- Биология открытий: Поддержка проверки гипотез путем разделения вариантов заряда и олигомерных форм, которые могут влиять на взаимодействие с мишенью или стабильность.
- Скрининг: Получение очищенных белковых фракций с определенной молярной массой, готовых для последующих анализов связывания или активности.
- Аналитика: Предоставление данных о молярной массе, радиусе инерции и показателях чистоты, полученных с помощью детекторов светорассеяния и показателя преломления, для сравнительного анализа в различных условиях.
- Трансляционные исследования: Обеспечение преемственности от этапа открытия до доклинической валидации путем характеристики критических показателей качества, таких как агрегация и гликозилирование.
- Корпоративное повторное использование: Использование в качестве универсального платформенного метода, применимого к различным белковым мишеням, включая моноклональные антитела, ферменты и мембранные белки.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает неопределенность механизмов за счет разделения совместно элюирующих компонентов по заряду и абсолютного определения молярной массы.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость метода за счет стандартизированной подготовки буферов, стабилизации базовой линии и протоколов вычитания холостой пробы.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) благодаря раннему получению данных о примесях, связанных с продуктом, и конформационной гетерогенности.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию кандидатов с учетом рисков на основе ортогонального анализа чистоты, олигомерного состояния и профилей зарядовых вариантов.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области хроматографии, теории светорассеяния и анализа данных с использованием аппроксимации по модели Цимма.
- Необходим доступ к системам FPLC, оснащенным детекторами MALS, DLS и рефрактометрами, а также подходящими колонками (например, для анионообменной хроматографии).
- Требуется межкомандная стандартизация фильтрации буферов, подготовки образцов и программирования градиента для обеспечения воспроизводимости.
- Предусматривается необходимость адаптации метода под различные свойства белков, например, корректировка pH и градиентов соли для разделения конкретных вариантов заряда.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость стабилизации базовой линии и вычитания холостого опыта для коррекции дрейфа сигнала RI при использовании солевых градиентов.
