Ионообменной хроматографии (IEX) в сочетании с мульти-угол рассеяния света (MALS) для разделения белков и характеристика

Этот протокол представляет ионно-обмен MALs, новый метод контроля качества белка и характеристики, контроль качества, который имеет важное значение для согласованности и целостности результатов в исследованиях науки о жизни и разработки фармацевтических продуктов. Ионно-обмен MALS определяет чистоту белка, олигомерное состояние, однородность, идентичность, конформацию, структуру, пост-перевод изменений и другие свойства. Измерения неразрушаются и проводятся в растворе в почти физиологических буферных условиях.

Этот метод точно определяет молярную массу белков или пептидов, олигомерное состояние и степень спряжения, например, гликопротеинов. Он также может быть применен к мембранным белкам. IEX отделяет макромолекулы по их поверхности заряда.

Обмен анионом, AIEX и катионная биржа, CIEX, матрицы связывают отрицательно и положительно заряженные варианты соответственно. При тонком разделении белковых популяций, которые имеют относительно тесную массу или форму, IEX-MALS успешно определяет молярную массу каждого отдельного состояния белка в образце смеси. Для начала используйте 0,1-микрометровый фильтр для фильтрации всех реагентов, включая буферы для стирки и элауции.

Фильтр первых 50 до 100 миллилитров буфера в бутылку отходов для того, чтобы устранить частицы из сухих фильтров. В чистой, стерильной бутылке, которая была тщательно промыта фильтрованной водой и ограничена, чтобы предотвратить проникновение пыли, фильтруем оставшуюся часть буфера. С буфером pH-eight Tris и 50-миллимолярным хлоридом натрия разбавляйте образец BSA до шести миллиграммов на миллилитр, поэтому рН и ионная прочность позволят связываться с ионно-обменной колонкой.

Используйте шприц, чтобы ввести по крайней мере от 0,3 до 0,5 миллиграммов BSA в одноми миллилитровую колонку для достижения хорошего качества malS анализа. Для начала эксперимента по обмену ионом MALS откройте New, Experiment from Method в программном обеспечении MALS, а также выберите онлайн-метод из папки методов Light Scattering System. Если модуль DLS доступен и данные DLS должны быть приобретены, выберите онлайн-метод из рассеяния света, с субфолдером QELS.

Для настройки параметров в разделе Конфигурация сначала установите скорость потока бега в разделе Generic Pump на скорость потока, используемую в FPLC, как 1,5 миллилитров в минуту. В разделе Solvent введите или пройдите проверку параметров буфера. В разделе Инжектор введите название белка как BSA, рефракционный индекс увеличивается на 0,185 миллилитров на грамм, а коэффициент уф-вымирания на длине волны 280 нанометров составляет 0,66 литра на грамм сантиметра.

Во вкладке Пример введите концентрацию образца белка в шесть миллиграммов на миллилитр, а затем вставьте объем образца для инъекций в качестве 170 микролитров. В разделе Процедуры во вкладке «Основная коллекция» выберите триггер флажка на Auto-Inject и установите продолжительность запуска до 70 миллилитров, чтобы сбор данных продолжался в течение по крайней мере пяти минут после того, как градиент достиг своего конечного значения. Затем, в программном обеспечении FPLC, создайте новый эксперимент во вкладке Редактор метода.

Для первоначального эксперимента создайте линейный градиент соли или рН, в то время как для оптимизированного метода создайте более специфический градиент или пошаговую программу согласно рукописи. Включите импульсный сигнал в метод, который вызовет сбор данных в программном обеспечении MALS. Затем откройте насосный клапан и промойте 0,5-молярным гидроксидом натрия, чтобы удалить сильно связанные примеси, а затем нейтрализовать буферную стирку.

Затем вымойте столбец буфером Tris pH eight, клапаном A с буфером для мытья и клапаном B с буфером elution. Используйте буфер для мытья с низкой концентрацией соли в качестве окончательной стирки для полоскания колонны, чтобы обеспечить привязку белка к матрице колонки. Перед инъекцией образца, после мытья, и в конце элюции, светоизбрасывающий базовый уровень должен быть стабилизирован, чтобы обеспечить низкий уровень шума и полностью чистое разбавление.

Используя шприц, поместите образец белка в петлю. Начните эксперимент сначала в программном обеспечении MALS, нажав на кнопку Run, а затем в программном обеспечении FPLC. Данные будут собираться после получения импульсного сигнала от прибора FPLC через детектор MALS.

Если ионно-обмены MALS выполняются вручную в режиме непрерывного потока вместо автономного метода, примените те же параметры запуска и инструкции, что и ранее описанные. После проверки и запуска окончательного метода выполните точно такой же метод, используя пустую инъекцию, загрузив буфер вместо образца. Важно, чтобы время между импульсом автоматического впрыска и градиентом пустого запуска было идентично времени запуска образца.

Для начала анализа, в разделе Процедуры в программном обеспечении MALS, используйте вкладку Despiking и нормальный уровень, чтобы сгладить хроматограммы. Если они проявляют много шума, установить уровень тяжелых. В базовом представлении определите базовый уровень для всех сигналов, включая детекторы LS, UV и RI.

В представлении Пики определите пики для анализа. Прояви правильные значения прироста RI dn/dc и коэффициента уф-вымирания для белка под каждым пиком. Под моларной массой и радиусом от света рассеяния зрения, анализировать молярной массы и радиуса с помощью модели Зимм и подходят степени нуля.

Если имеется в наличии еЛС, под видом Rh с точки зрения КУЕЛС, соблюдайте значения Rh и качество соответствия функции корреляции. Сигнал RI значительно меняется во время ионно-обменного MALS запуска из-за увеличения концентрации соли. Чтобы вычесть базовый сигнал из пустой инъекции, откройте как белок, так и пустой ионный обмен MALS экспериментов.

Нажмите правой кнопкой мыши на название белкового эксперимента, выберите метод применения и выберите папку «Базовое вычитание» из диалога файлов. Выберите онлайн-метод для стандартного анализа молярной массы. В соответствии с базовым представлением вычитания нажмите Import Blank, чтобы импортировать сигналы пустого запуска.

В соответствии с инструментами, проверить все детекторы вычесть. Для калибровки ионно-обменной системы MALS с мономером BSA, под процедурами и представлением конфигурации, выравнивайте пики. В представлении о нормализации введите 3,0 нанометров в качестве значения Rg для выполнения нормализации.

Затем, под band Broadening в той же вкладке Конфигурация, выберите пик и используйте кнопку Perform Fit, чтобы соответствовать УФ-сигналам и сигналам LS к сигналу RI. График результатов отображается в представлении Results Fitting. Измените весы оси и другие параметры графика, нажав правой кнопкой на графике, выбрав Редактировать, а затем нажав на кнопку Advanced.

Чтобы иметь больше вариантов отображения, выберите вкладку EASI Graph, а в верхней части окна в меню высадки дисплея выберите Molar Mass или Rh.Все результаты, включая молярную массу, радиус, уровень чистоты и другие доступны в представлении Отчета в разделе Результаты. Используйте кнопку «Дизайнер отчетов», чтобы добавить в отчет больше результатов или параметров, а также цифры. В этом эксперименте BSA была проанализирована на ионно-обмене MALS с помощью аналитической колонки обмена анионом.

Хроматограммы отображали УФ на 280 нанометров, рассеяние света под углом 90 градусов, рефракционный индекс и кривые проводимости вместе с молярной массой каждого пика. Широкий линейный градиент, состоящий из 30 объемов столбца от 75-миллимоляра до 350-миллимолярского хлорида натрия, отделил мономеры BSA от димеров и высших олигомеров. Анализ MALS ниже по течению привел к расчетной мономерной молярной массе 66,8 килодалтонов и рассчитанной более тусклой молярной массе 130 килодальтонов.

Основываясь на проводимости буфера на элективных пиках, градиент был изменен на другую программу, длинный шаг 175-миллимолярского хлорида натрия, за которым последовал линейный градиент от 175-миллимолярского до 500-миллимолярского хлорида натрия. Новый градиент значительно улучшил разрешение и произвел отличное разделение между мономером BSA и высшими олигомерными видами. Пошаговая программа 200-миллимолярского и 250-миллимолярского хлорида натрия была применена, чтобы сосредоточиться также на высоких олигомерных видах.

Это привело к отличному разделению между мономером BSA, димером и тримером. Следуя этой процедуре, такие методы, как масс-спектрометрия, SDS-PAGE деятельности и стабильности тесты могут быть выполнены на каждом варианте разделены ионный обмен для выявления и дальнейшей характеристики каждого из них. Мы обнаружили, что ионный обмен MALS расширяет полномочия malS-анализа на образцы, которые не могут быть полностью проанализированы SEC-MALS.

Разделение по обвинению решить различные виды, которые coelute в SEC.