Модель in экстракорпоральное для изучения агрегация Тау с использованием ленто-вирусно-опосредованное производство нейронов человека
23 мая 2019 г.
Этот протокол детализирует процедуру, в которой нейронные культуры человека преобразуются с лентивирусными конструкциями, кодирующие для мутантного человека Тау. Трансдуктед культур отображения Тау агрегатов и сопутствующих патологий.
В этом протоколе мы подробно в пробирке модель человеческой тауопатии. Этот метод заполняет потребность в материалах, которые могут быть полезны для скрининга лекарств и исследований механизма заболевания. Основным преимуществом этой техники является то, что парадигма клеточной культуры позволяет более быстро оценить токсичность тау и потенциальную тау-терапевтику по сравнению с исследованиями на животных, чтобы начать эту процедуру оттепели оболочки мембраны покрытия для культуры пластин на четыре градуса по Цельсию.
Сделайте одноми миллилитровые алициты и храните их при температуре минус 20 или минус 70 градусов по Цельсию. Далее, восстановить основной фактор роста фибробластов в стерильных PBS при концентрации 10 микрограмм на миллилитр. Сделайте 10-микролитровые алициты и храните их при четырех градусах цельсия.
Затем отправился новый неоткрытый 500-миллилитровый бутылку DMEM-F12 с глутамином. Добавьте 10 миллилитров B27, пять миллилитров N2 и пять миллилитров пенициллина-стрептомицина для подготовки нервных стволовых клеток. Поместите 50 миллилитров НСК-медиа в коническую трубку и добавьте 10 микролитров подготовленного bFGF.
Храните этот NSC плюс bFGF СМИ при четырех градусах по Цельсию. Во-первых, удалить aliquot замороженных мембранных мембранных покрытий для пластин клеточной культуры из морозильной камеры, и это позволяет оттаивать при четырех градусах по Цельсию. Добавьте 385 микролитров оттаялого мембранного мембранного матричного покрытия к пяти миллилитров средств массовой информации DMEM-F12, содержащих пенициллин-стрептомицин.
Если клетки оттаивают от замороженных запасов НСК, возьмите флакон замороженных клеток из морозильной камеры и согреть его в водяной бане, нагретой до 37 градусов по Цельсию, перемещая флакон туда и обратно в воду. После этого распылите флакон 70%этанолом. Затем под капотом клеточной культуры, передать клетки примерно 10 миллилитров DMEM-F12 средств, содержащих пенициллин-стрептомицин.
Центрифуга при комнатной температуре 1000 раз г в течение пяти минут. Затем аспирировать средства массовой информации и повторного перерасхода ячеек в НСК СМИ. Разбавить клетки в средствах массовой информации НСК, чтобы получить соответствующую плотность посева для сосуда клеточной культуры, который используется.
Добавить достаточно клеток приостановлено в средствах массовой информации НСК, чтобы семена мембраны подвала матрицы покрытием культуры блюд. Выращиваем клетки при 37 градусах Цельсия с 5%-ным углекислым газом до тех пор, пока они не будут на 75-80% совлиять, убедившись, что они меняют средства массовой информации через день. Чтобы вывести нейроны с лентивирусом, используйте titer кол 340000 предуваемых единиц на клетку.
Разбавить превью единиц в клеточной культуре средств массовой информации в необходимой концентрации, и добавить их в клетки. Через два дня после добавления лентивируса, мыть клетки один раз со свежими средствами массовой информации, которые не содержат bFGF. Продолжить культивирование клеток при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в средствах массовой информации без bFGF.
Поддерживайте клетки в течение примерно восьми недель после трансдукции, убедившись, что изменить медиа культуры клеток через день. Используйте световой микроскоп, чтобы регулярно визуализировать клетки и обеспечить жизнеспособность. После трансдукции, удалить культуру блюда из инкубатора убедившись, что держать крышку на них, чтобы сохранить культуру хорошо стерильной.
Используйте флуоресцентный микроскоп, способный живую визуализацию клеток, чтобы визуализировать клетки под 10X цели с возбуждением 514 нанометров и эмиссионного фильтра 527 нанометров. В этом исследовании нейроны, вызванные tau-RDLM-YFP лентивирус флуоресцентно помечены YFP. Культуры, вызванные RDLM, отображают агрегаты после трансдукции.
Эти включения пятно положительное для thioflavin. Нейронная дифференциация подтверждается иммунолабелированием нейронного маркера бета-тубулина III в культурах. Важно помнить, что флуоресцентно помеченные вторичные антитела должны иметь возбуждающий спектр выбросов, который не пересекается с спектром YFP.
Хотя желтые агрегаты флуоресценции тау будут видны при отсутствии окрашивания, тиофлавин также следует использовать для визуализации, чтобы подтвердить, что флуоресцентный сигнал агрегируется тау, а не клеточный мусор. После генерации тау overexpressing клеток, ряд оценок здоровья нейронов и тау агрегации могут быть выполнены. Например, мы обнаружили, что эти клетки отображают аксональной дегенерации.
В дополнение к исследованиям клеточной культуры, мы использовали этот метод для изучения патогенности экзосомно-производных тау.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол создания модели таупатии человека in vitro путем трансдукции нейрональных культур лентивирусными конструктами, кодирующими мутантный тау-белок человека. Данная модель позволяет проводить более быструю оценку токсичности тау-белка и поиск потенциальных терапевтических средств по сравнению с традиционными исследованиями на животных.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Таупатии
Теоретическая часть
- Таупатии человека представляют собой нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся агрегацией тау-белка.
- Традиционные модели часто требуют длительного времени реализации и не всегда отражают патологию человека.
- В данном протоколе представлена более быстрая и специфичная парадигма оценки с использованием клеточных культур.
- Этот подход позволяет преодолеть ограничения животных моделей при изучении взаимодействий тау-белка.
Цель исследования
- Разработать модель культуры нейронов человека для изучения патологии тау-белка.
- Оказать помощь в скрининге лекарственных препаратов для лечения заболеваний, связанных с тау-белком.
- Способствовать пониманию роли тау-белка в нейродегенерации.
Используемые методы
- Используемая платформа представляет собой систему культуры нейронов человека.
- Биологическая модель состоит из нейронов человека, трансдуцированных мутантным tau с помощью лентивирусных конструкций.
- В тексте не упоминается рабочий процесс мультиомики.
- Клетки поддерживают в течение примерно восьми недель после трансдукции, регулярно меняя среду.
- Для визуализации агрегации tau применяют световую и флуоресцентную микроскопию.
Основные результаты
- В трансдуцированных культурах наблюдались агрегаты тау-белка, что было подтверждено окрашиванием тиофлавином.
- Нейрональная дифференцировка была подтверждена иммуномаркированием бета-тубулина III.
- Наблюдения указали на аксональную дегенерацию в клетках с гиперэкспрессией тау-белка.
- Исследование подчеркивает пригодность данной модели для оценки состояния нейронов при таупатиях.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует надежный подход in vitro для изучения таупатий и оценки токсичности тау-белка.
- Разработанная модель открывает возможности для тестирования потенциальных терапевтических средств против таупатий.
- Полученные данные могут углубить понимание механизмов агрегации тау-белка и нейродегенерации.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данная модель нейронов человека in vitro восполняет критический пробел в исследовании таупатий, предоставляя релевантную человеческую систему для экспресс-оценки агрегации тау-белка и нейротоксичности. Она позволяет проводить валидацию мишеней на ранних этапах и снижать механистические риски при разработке препаратов, нацеленных на тау-белок, уменьшая зависимость от длительных исследований на животных. Модель обеспечивает прогностическую уверенность при идентификации перспективных соединений-лидеров и предварительном отборе в рамках программ по изучению нейродегенеративных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Исследование патогенных мутантов tau в нейронах человека для валидации терапевтических мишеней и выяснения механизмов агрегации.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней с помощью количественных показателей, таких как изменение длины аксонов и объема лизосом.
- Прогностическая ценность: Помогает в приоритизации портфеля разработок путем моделирования специфичной для человека патологии tau и профилей токсичности.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Создание стандартизированных флуоресцентно меченых агрегатов тау-белка, детектируемых с помощью YFP и окрашивания тиофлавином, для скрининга соединений.
- Количественные показатели: Позволяет измерять нагрузку агрегации и нейротоксические фенотипы в качестве зависимых переменных в анализах «доза-эффект».
- Масштабируемость: Лентивирусная трансдукция обеспечивает стабильное и масштабируемое получение релевантных для заболевания нейронных культур для высокопроизводительного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для исследования заболеваний: использование нейронов человека, экспрессирующих патогенные мутанты tau-белка, для моделирования ранних событий при болезни Альцгеймера и связанных с ней таупатиях.
- Трансляционная преемственность: связывает этап фундаментальных открытий и доклинических исследований, предоставляя клеточную систему человека для изучения механизмов действия.
- Принятие решений с учетом рисков: позволяет оценивать соединения, нацеленные на tau-белок, в системе, демонстрирующей наличие тиофлавин-положительных агрегатов и дегенерацию нейритов.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данная модель вписывается в континуум процесса разработки — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до проведения доклинических испытаний эффективности, обеспечивая итерационные циклы «дизайн-синтез-тест» для модуляторов тау-белка.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о мутантах tau и уточнять сигнальные пути с помощью прижизненной визуализации маркеров агрегации и токсичности.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу культур со стандартизированными фенотипами трансдукции и агрегации для оценки библиотек соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные зависимые переменные, включая флуоресцентную нагрузку агрегатов, длину аксонов и объем лизосом для статистического сравнения.
- Трансляционные исследования: способствует доклинической валидации путем моделирования патологии tau человека в редукционистской системе.
- Повторное корпоративное использование: создает универсальную платформу для тестирования множества конструктов tau, ингибиторов или подходов к редактированию генов в рамках различных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в выборе мишени за счет моделирования таупатий человека с использованием патогенных мутантов и подтверждения наличия агрегатов с помощью положительного теста с тиофлавином.
- Практическая ценность: предлагает экономически эффективную и воспроизводимая систему с определенным составом сред, протоколами трансдукции и восьминедельным графиком культивирования.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), предоставляя ранние данные о нейротоксичности и эффективности, релевантные для человека.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять риск-ориентированное продвижение препаратов для терапии таупатий на основе показателей агрегации и дегенерации нейритов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами нейронов, лентивирусной трансдукцией и флуоресцентной микроскопией.
- Зависит от наличия доступа к нейральным стволовым клеткам человека, лентивирусным векторам и оборудованию для визуализации с соответствующими наборами фильтров.
- Необходимо стандартизировать титр трансдукции (340,000 TU/cell) и составы сред во всех центрах.
- Потребуется адаптация протокола для различных мутантных форм tau или репортерных конструкций, помимо tau-RDLM-YFP.
- Ограничено восьминедельным периодом культивирования и возможной вариабельностью эффективности формирования агрегатов.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Preparation of Media and Reagents
1:41
Culturing Human Neural Stem Cells
3:12
Transduction and Maintenance of Neuronal Cultures
4:05
Live-cell Imaging
4:32
Results: Analysis of Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons
5:22
Conclusion
