Возбуждение-сканирование гиперспектральной микроскопии изображений для эффективной дискриминации сигналов флуоресценции
22 августа 2019 г.
Спектральная визуализация стала надежным решением для идентификации и разделения множественных сигналов флуоресценции в одном образце и может легко отличить сигналы интереса от фона или автофлюоресценции. Экзитс-сканирующая гиперспектральная визуализация улучшает эту технику, уменьшая необходимое время приобретения изображения, одновременно увеличивая соотношение сигнала к шуму.
Этот протокол имеет важное значение, поскольку он описывает метод, который может быть использован для разделения нескольких флуоресцентных сигналов в одном образце. По сравнению с традиционными методами, возбуждение-сканирование может увеличить скорость эксперимента и повысить чувствительность данных. Используя различные источники освещения, такие как суперконтинумный лазер, этот метод может быть применим к спиннинг диска или лазерного сканирования конфокальных систем микроскопа.
При выполнении возбудителя-сканирования, спектральной микроскопии изображений, важно проверить, что пик возбуждения каждой флуоресцентной метки происходит на разной длине волны. Для начала наймите перевернутый флуоресцентный микроскоп и камеру, как описано в текстовом протоколе. Затем загрузите образец на сцену.
Из выпадают меню микроменеджер главного окна, выберите 475 нанометров для первоначального просмотра образца. Затем дважды нажмите на поле рядом с экспозицией и введите 100, чтобы установить время экспозиции на 100 миллисекунд. Наконец, нажмите в прямом эфире, чтобы просмотреть образец.
Теперь нажмите на Auto. Кнопка автоматического диапазона интенсивности, чтобы принести минимальные и максимальные значения в значимые, визуальные диапазоны. Затем используйте ручки фокусировки микроскопа, чтобы сфокусировать образец.
Оказавшись в фокусе, отрегулируйте положение образца так, чтобы его край был в центре поля зрения. Затем отладить фокус. Образец находится в фокусе, когда края объектов на изображении появляются острые.
Теперь откройте многомерный инструмент приобретения. В меню нажмите кнопку нагрузки и выберите заданную настройку, содержащую соответствующий диапазон длин волн для спектрального приобретения. Как только параметры приобретения подтвердятся, переместите в пустую область образца и нажмите кнопку acquire, чтобы собрать спектральный стек изображений, содержащий фон и шум, чтобы использовать для вычитания позже.
Затем перемести образец, чтобы найти самые яркие регионы. Образцы, вероятно, имеют более интенсивный флуоресценции от края образца. После того, как самая яркая область находится, возьмите один стек изображений.
Загрузите приобретенное изображение в Image J и используйте функцию измерения Image J, чтобы подтвердить, что ни одна длина волн не содержит переэкспонированных пикселей. Если из-за передержки требуется сокращенное время экспозиции, фоновое изображение также должно быть отбито с новым временем экспозиции. Если было установлено, что какое-либо из изображений содержит восходящий предел обнаружения камеры, отрегулируйте время экспозиции спектрального сканирования, чтобы гарантировать, что максимальный сигнал по всему спектральному диапазону не превышает динамический диапазон камеры.
С соответствующим временем экспозиции в настоящее время определяется, место необряхаемый образец на сцену. Приобретайте данные спектрального изображения из неоявного образца, чтобы определить, существует ли какая-либо основная аутофторенсия. Затем поместите на сцену одно помеченный образец.
Приобретайте данные спектральных изображений из каждого из одно помеченных образцов для использования в качестве спектрального управления для создания спектральной библиотеки. Выполните сканирование для каждого образца управления с использованием одинакового времени экспозиции диапазона длин волн и настроек камеры. Затем поместите слайд, содержащий экспериментальный образец, на микроскоп.
Выберите поле зрения, которое имеет соответствующие помеченные ячейки, и приобретете данные спектрального изображения из выборки с помощью определенных параметров приобретения. Исправьте изображения к плоской спектральной реакции, вычитая фоновый спектр из изображения образца и умножая изображение на коэффициент коррекции. Здесь для быстрой обработки изображений используется скрипт MATLAB.
Затем создать спектральную библиотеку. Для получения наилучших результатов нормализуете каждый конечный участник диапазона длин волн наибольшей интенсивности, определяя, какая длина волны имеет наиболее интенсивное значение, и разделяя измерение на каждой полосе длины волны на это максимальное значение. Затем сохраните спектральные данные в качестве файла DAT.
После завершения, не смешивайте данные спектрального изображения. Несмешающий шаг будет генерировать изобилие изображения для каждого флуоресцентного ярлыка, где изобилие количество относительного флуоресцентного сигнала на изображении от предполагаемой этикетки. Затем откройте каждое несмешаемое изображение, чтобы визуально проверить распределение чистых компонентов.
Сравните величину изображения ошибки с величиной несмешанных изображений. Если величина изображения ошибки похожа на несмешаемые изображения изобилия, сигналы в данных спектрального изображения не могут быть точно учтены. Наконец, убедитесь, что нет неопознанных остаточных структур, сравнив изображение ошибки с несмешанными изображениями.
При правильной работе спектральный процесс немиксирования позволяет разделение спектрального стека изображения на соответствующие вклады от каждой метки флуоресценции. Здесь, несмешанный спектральный набор изображений с отдельными изображениями подчеркнув дыхательных путей гладкой мышечной клетки аутофторесценции, зонд GCaMP и митохондриальной этикетке. Существует высокая погрешность, связанная с ядерными и перинуклеарными областями клеток, указывающими на то, что измеренные спектры этих областей не очень хорошо учитываются спектрами в спектральной библиотеке.
Чистые спектры, собранные из помеченных клеток, которые также аутофторесцентные, скорее всего, загрязняют спектральный профиль для чистого компонента. Здесь можно увидеть разницу в несмешии с чистыми спектрами, загрязненными аутофторесценцией, по сравнению с исправленными чистыми спектрами после масштабируемого вычитания. Правильное получение данных имеет важное значение, когда изображения чувствительных образцов, поскольку они могут выжить только один сеанс изображения в отличие от фона и элементов управления, которые могут быть reimaged.
Убедитесь, что надлежащие настройки оборудования и приобретения предопределены как можно больше. В качестве следующего шага видео, созданные из данных замедленного действия, полученных с помощью этой системы, могут быть использованы для отслеживания флуоресцентных источников в скрытых местах с течением времени, таких как локализация сигнала второго мессенджера. Позаботьтесь при использовании мощных источников света, чтобы избежать воздействия глаз.
Кроме того, не забудьте носить надлежащие перчатки при обработке биологических этикеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод разделения нескольких флуоресцентных сигналов в одном образце с помощью гиперспектральной визуализации со сканированием возбуждения. Этот метод увеличивает скорость проведения экспериментов и повышает чувствительность данных по сравнению с традиционными методами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Флуоресцентная микроскопия
- Методы визуализации
- Обработка сигналов
Теоретические сведения
- Флуоресцентные сигналы может быть трудно различить из-за фонового шума.
- Традиционные методы визуализации могут быть медленными и менее чувствительными.
- Гиперспектральная визуализация со сканированием возбуждения предлагает решение этих проблем.
- Для улучшения результатов могут быть использованы различные источники освещения.
Цель исследования
- Обеспечить надежный метод разделения нескольких флуоресцентных сигналов.
- Повысить скорость и чувствительность экспериментов по флуоресцентной визуализации.
- Продемонстрировать применимость данного метода к различным системам микроскопии.
Используемые методы
- Настройка инвертированного флуоресцентного микроскопа и камеры.
- Использование суперконтинуумного лазера в качестве источника освещения.
- Помещение образцов на предметный столик микроскопа.
- Проверка пиков возбуждения на разных длинах волн для каждого флуоресцентного маркера.
Основные результаты
- Гиперспектральная визуализация со сканированием по возбуждению значительно сокращает время сбора данных.
- Улучшенное отношение сигнал/шум повышает качество данных.
- Метод адаптируем для использования в конфокальных системах с вращающимся диском или лазерным сканированием.
- Продемонстрировано успешное разделение нескольких сигналов флуоресценции.
Выводы
- Гиперспектральная визуализация со сканированием возбуждения является ценным инструментом для исследователей.
- Данный метод позволяет добиться более эффективной и чувствительной флуоресцентной визуализации.
- В будущем область применения этого метода может расшириться на различные сферы биологических исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Гиперспектральная визуализация со сканированием по возбуждению устраняет ключевое узкое место в рабочих процессах открытий на основе флуоресценции: невозможность быстрого и чувствительного разделения перекрывающихся сигналов от нескольких зондов в сложных биологических образцах. За счет повышения скорости сбора данных и отношения сигнал/шум этот метод повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и снижении рисков при изучении механизмов, особенно в рамках фенотипического скрининга на ранних стадиях, где разделение сигналов имеет решающее значение. Совместимость метода со стандартными платформами микроскопии обеспечивает возможность масштабируемой интеграции в корпоративные конвейеры визуализации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем изоляции флуоресцентных сигналов от различных зондов, что уточняет степень активации путей и специфичность мишени.
- Практическая ценность: снижает неопределенность механизмов за счет спектрального разделения, обеспечивая функциональную валидацию мишени с помощью количественной деконволюции сигналов.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность идентификации перспективных соединений-лидеров за счет минимизации количества ложноположительных результатов, вызванных спектральным перекрытием или интерференцией автофлуоресценции.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем создания спектральных библиотек, обеспечивающих воспроизводимые количественные результаты.
- Масштабируемость: поддержка повторного использования платформы в различных проектах благодаря стандартизированным рабочим процессам сбора данных и развертки спектров, что сокращает время на повторную разработку анализа.
- Количественные результаты: получение изображений содержания для каждого флуорофора, что позволяет точно сравнивать интенсивность сигнала при различных условиях для отбора перспективных соединений (хитов).
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает точность сигнала на всех этапах — от открытия до доклинических моделей — за счет коррекции автофлуоресценции и спектрального загрязнения.
- Продвижение с учетом рисков: поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), предоставляя чистые, неперекрывающиеся данные по каналам, которые отражают истинный биологический сигнал, а не артефакты.
- Механистическое снижение рисков: изолирует сигналы от органелл или компартментов (например, митохондрий, цитозоля) для подтверждения взаимодействия с мишенью в системах, релевантных конкретному заболеванию.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в общий цикл разработки — от предварительной валидации мишени до оптимизации соединений-лидеров, где мультиплексный флуоресцентный анализ используется для оценки механизмов действия, токсичности и модуляции сигнальных путей. Он обеспечивает надежную передачу данных между отделами биологии и аналитики за счет предоставления стандартизированных, количественно измеримых результатов визуализации.
- Биология открытий: Поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей путем разделения сигналов от нескольких меток (например, GCaMP, митохондриальный краситель, аутофлуоресценция) при визуализации живых клеток.
- Скрининг: Повышает готовность анализа за счет воспроизводимого получения спектров и вычитания фона, что улучшает Z-фактор и достоверность определения хитов.
- Аналитика: Предоставляет карты распределения без спектрального перекрытия и метрики ошибок, которые позволяют проводить статистическое сравнение вкладов флуорофоров в разных экспериментальных группах.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает связь с доклинической валидацией, гарантируя, что флуоресцентные сигналы, используемые в качестве биомаркеров, не искажены спектральным перекрытием или аутофлуоресценцией.
- Корпоративное повторное использование: Создает централизованную спектральную библиотеку и стандартную рабочую процедуру (SOP) для гиперспектрального получения данных, что способствует единообразию между проектами и сокращает избыточную разработку методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования при валидации мишеней за счет снижения спектральной неопределенности и повышения достоверности сигнала.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и пропускную способность за счет ускоренного сбора данных и стандартизированной калибровки с использованием освещения суперконтинуумом.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя получать больше данных из одного образца и сокращая количество повторных сессий визуализации из-за плохого разделения сигналов.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков, предоставляя более чистые и интерпретируемые данные визуализации для принятия решений на этапах перехода от поиска мишеней к доклиническим исследованиям.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области флуоресцентной микроскопии, спектрального анализа изображений и владение инструментами обработки изображений, такими как ImageJ и MATLAB.
- Метод зависит от наличия перестраиваемых источников освещения (например, суперконтинуумного лазера) и детекторов с достаточным динамическим диапазоном и чувствительностью.
- Для обеспечения воспроизводимости результатов необходима межгрупповая стандартизация настроек сбора данных, времени экспозиции и процесса создания спектральных библиотек.
- Необходимо учитывать автофлуоресценцию в биологических образцах, что требует проведения контрольных измерений и спектрального вычитания для предотвращения загрязнения спектров чистых компонентов.
- В исследованиях живых клеток метод ограничен рисками фототоксичности, что требует тщательного контроля экспозиции для сохранения жизнеспособности образца во время сбора данных.
