Name: Использование CRISPR/Cas9 для выбивания GM-CSF в клетках CAR-T (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Узнайте генетическую модификацию CAR-T клеток с помощью CRISPR/Cas9 для повышения эффективности и снижения токсичности иммунотерапии рака. Этот метод оптимизирует производство клеток.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана за счет грантов от K12CA090628 (SSK), Национальной комплексной онкологической сети (SSK), Клиника Майо Центр индивидуальной медицины (SSK), Фонд Предолин (SSK), клиника Майо Бюро перевода на практике (SSK), и Клиника Майо Медицинская Программа обучения ученых Роберт Л. Хауэлл Врач-ученый стипендий (RMS).

<ol><li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li>
<li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li>
<li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome+editing%3A+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li>
<li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
</ol>

SSK является изобретателем патентов в области Т-клеточной терапии CAR, которые лицензированы Novartis (в соответствии с соглашением между клиникой Майо, Университетом Пенсильвании и Novartis). Эти исследования частично финансировались за счет гранта от Humanigen (SSK). RMS, MJC, RS и SSK являются изобретателями патентов, связанных с этой работой. Лаборатория (SSK) получает финансирование от Tolero, Humanigen, Kite, Lentigen, Morphosys и Actinium.

В этом отчете мы описываем методологию использования технологии CRISPR/Cas9 для индуцирования вторичных изменений в клетках CAR-T. В частности, это продемонстрировано с помощью лентивирусной трансдукции с вирусным вектором, который содержит gRNA ориентации гена интереса и Cas9 для создания ГМ-CSFк / о CART19 клеток. Ранее мы показали, что нейтрализация GM-CSF упрощает CRS и NT в модели ксенотрансплантата. 12 Как уже говорилось ранее, ГМ-CSFk/o CAR-T-клетки позволяют ингибиров...

Химерный рецептор антигена T (CAR-T) клеточная терапия демонстрирует большие перспективы в лечении рака. 1 , 2 Две CAR-T клеточной терапии ориентации CD19 (CART19) были недавно утверждены в Соединенных Заявленные и в Европе для использования в злокачественных новообразованиях клеток B после демонстрации поразительных результатов в многоцентровых клинических испытаний. 3 , 4 , 5 Барьерами для более широкого использования CAR-T-клеток являются ограниченная активность в твердых опухолях и связанных с ними токсичности, включая синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейротоксичность (NT). 3 , 5 , 6 , 7 (г. , 8 , 9 Для повышения терапевтического индекса клеточной терапии CAR-T, инженерные инструменты генома, такие как нуклеазы цинковых пальцев, TALENs и CRISPR используются для дальнейшего изменения car-T-клеток в попытке создать менее токсичные или более эффективные клетки CAR-T. 10 Лет , 11 Год
В этой статье мы описываем метод создания CRISPR/Cas9, отредактированных CAR-T-ячеек. Конкретная цель этого метода заключается в том, чтобы генетически модифицировать CAR-T-клетки во время производства клеток CAR-T через CRISPR/Cas9 для создания менее токсичных или более эффективных клеток CAR-T. Обоснование для разработки этой методологии основывается на уроках, извлеченных из клинического опыта клеточной терапии CAR-T, что указывает на настоятельную необходимость новых стратегий для увеличения терапевтического окна клеточной терапии CAR-T и расширения применения в других опухолей и поддерживается последние достижения в синтетической биологии позволяет несколько модификаций CAR-T клеток, которые начали поступать в клинику. В то время как несколько инженерных инструментов генома разрабатываются и применяются в различных условиях, таких как нуклеазы цинковых пальцев, TALENs и CRISPR, наша методология описывает модификацию CRISPR/Cas9 клеток CAR-T. 10 Лет , 11 CRISPR/Cas9 является РНК-механизм защиты от бактерий, который предназначен для устранения чужеродных ДНК. CRISPR полагается на эндонуклеазы, чтобы расщеплять целевую последовательность, идентифицированную через направляющий РНК (gRNA). CRISPR редактирования CAR-T клеток предлагает ряд преимуществ по сравнению с другими инструментами инженерного генома. К ним относятся точность последовательности gRNA, простота для разработки gRNA ориентации гена интереса, высокая эффективность редактирования генов, и способность целевых нескольких генов, поскольку несколько гРНК могут быть использованы в то же время.
В частности, в методах, описанных здесь, мы использовали лентивирус, кодируя CRISPR руководство РНК и Cas9 нарушить ген во время трансдукции Т-клеток CAR. При выборе подходящей техники для редактирования CAR-T-клеток, мы предлагаем метод, описанный здесь является эффективным механизмом для создания исследований класса CAR-T клеток, а потому, что долгосрочный эффект постоянной интеграции Cas9 в геном неизвестен, мы предложить эту методологию для разработки доказательства концепции исследования класса CAR-T клеток, но не для производства хорошей производственной практике класса CAR-T клеток.
В частности, здесь мы описываем генерацию гранулоцитов макрофагов колонии стимулирующий фактор (GM-CSF) нокаутОМ CAR-T клеток ориентации человека CD19. Эти клетки CAR-T были созданы путем трансдукции с лентивирными частицами, кодируя направляющую РНК, специфичную для GM-CSF (генное название CSF2) и Cas9. Ранее мы обнаружили, что нейтрализация GM-CSF упрощает CRS и NT в модели ксенотрансплантата. 12 ГМ-CSFk/o CAR-T-клетки позволяют ингибировать ГМ-CSF в процессе производства, эффективно снижая производство ГМ-CSF при одновременном повышении противоопухолевой активности CAR-T и выживания в vivo по сравнению с клетками WILDtype CAR-T. 12 Таким образом, здесь мы предоставляем методологию для создания CRISPR/Cas9 отредактированные клетки CAR-T.

<table><tbody><tr><td>CD3 моноклональное антитело (OKT3), ПЭ, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>CD3 моноклональное антитело (UCHT1), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0038-42</td><td></td></tr><tr><td>Choice Taq Blue Mastermix</td><td>Denville Scientific</td><td>C775Y51</td><td></td></tr><tr><td>CTS (системы клеточной терапии) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td><td>Beckman Coulter</td><td>C10343</td><td>проточный цитометр</td></tr><tr><td>диметилсульфоксид</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Minerals Buffered</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S (концентратор магнитных частиц)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Набор для изоляции Т-клеток человека&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951</td><td>магнитные шарики негативного отбора; 17951RF включает наконечники и буфер</td></tr><tr><td>Фетальная бычья сыворотка</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse Anti-Human CD107a&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>Среда фиксации (среда A)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS001S100</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR gRNA Конструкция: Название: CSF2 CRISPR направляющая РНК 1; Вид: Человек, Вектор: pLentiCRISPR v2; Резистентность: ампициллин; Номер экземпляра: High; Плазмидный препарат: Стандартная поставка: 4 мкм; g (бесплатно за дополнительную плату)</td> <td>GenScript</td><td>N/A</td><td>Индивидуальный заказ</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Parent, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>https://tide.nki.nl.</td>Сыворотка АВ для человека <td>Desktop Genetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>; мужчины-доноры; тип АВ; US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>ИФН гамма-моноклональное антитело (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>47-7319-42</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Реагент для трансфекции</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Stain Kit, для возбуждения 405 нм</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Monensin Solution, 1000X</td><td>BioLegend</td><td>420701</td><td></td></tr><tr><td>Мышь Античеловеческий CD28 Клон CD28.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>559770</td><td></td></tr><tr><td>Мышь Античеловеческий CD49d Клон 9F10</td><td>BD Pharmingen</td><td>561892</td><td></td></tr><tr><td>мышь Античеловеческий MIP-1&beta; PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>560687</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Морозильный контейнер</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NALM6, клон G5&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3273</td><td>клеточная линия острого лимфобластного лейкоза</td></tr><tr><td>Нуклеазная вода без нуклеазы</td><td>Promega</td><td>P119C</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Вакуумные фильтрующие системы, 500 мл, мембрана PES, 0,22 мкМ, стерильная</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-flow стерильные одноразовые фильтрующие установки с CN мембраной 0,45 мкМ</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Сниженная сыворотка Среда (1X), жидкая</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Мышиный античеловеческий IL-2</td><td>BD Horizon</td><td>562384</td><td></td></tr><tr><td>пенициллин-стрептомицин-глутамин (100X), жидкая</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>проникающая среда (среда B)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS002S100</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182001</td><td></td></tr><tr><td>Пуромицина дигидрохлорид</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td></td><td></td>0210055210</tr><tr><td>QIAquick Набор для экстракции геля</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-Human GM-CSF BV421</td><td>BD Horizon</td><td>562930</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>Полностью автоматизированный сепаратор клеток</td></tr><tr><td>SepMate-50 (IVD)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>Азид натрия, 5% (w/v)</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Бессывороточный гемопоэтический клеточный</td> средний <td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

Использование crispr/cas9 для выбивания gm-csf в клетках car-t

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Химерный рецептор антигена T (CAR-T) клеточная терапия является передний край и потенциально революционный новый вариант лечения рака. Тем не менее, существуют значительные ограничения на его широкое применение в лечении рака. Эти ограничения включают в себя развитие уникальных токсичностей, таких как синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейротоксичность (NT) и ограниченное расширение, функции эффектора и противоопухолевую активность в твердых опухолях. Одной из стратегий повышения эффективности CAR-T и/или контроля токсичности клеток CAR-T является редактирование генома самих клеток CAR-T во время производства клеток CAR-T. Здесь мы описываем использование редактирования генов CRISPR/Cas9 в клетках CAR-T с помощью трансдукции с лентивирусной конструкцией, содержащей направляющий РНК к гранулоцитной колонии-стимулирующего фактора (GM-CSF) и Cas9. В качестве примера мы описываем CRISPR/Cas9 при посредничестве GM-CSF. Мы показали, что эти ГМ-CSFк / о CAR-T клетки эффективно производят меньше ГМ-CSF при сохранении критической функции Т-клеток и привести к повышению противоопухолевой активности in vivo по сравнению с дикими клетками типа CAR-T.

На рисунке 1 показано сокращение ГМ-CSF в клетках GM-CSFk/o CART19. Чтобы убедиться, что геном Т-клеток был изменен на нокаут ГМ-CSF, tide секвенирования был использован в GM-CSFк / о CART19 клеток (Рисунок 1A). CAR-T клеточной поверхности окрашивания проверяет, что Т-клетки успешно выразить CAR поверхности рецептора in vitro путем gating на живых клетках CD3 "(Рисунок1B). Внутр...

Здесь мы представляем протокол для генетического отсвагивая клетки CAR-T через систему CRISPR/Cas9.

Использование CRISPR/Cas9 для выбивания GM-CSF в клетках CAR-T

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Наш протокол описывает генетическую модификацию клеток CAR-T во время их производства с помощью технологии CRISPR для создания более эффективного и менее токсичного продукта. Преимуществом этого метода является то, что производство клеток CAR-T и генетические манипуляции могут происходить в одной клетке с хорошей эффективностью. Демонстрация процедуры будет Розали Стернер, доктор философии студент, Мишель Кокс, технолог и аспирант, и Реона Sakemura, аспирант, из моей лаборатории.Изолировав Т-клетки от собранных периферических моноядерных клеток крови, начните их культивирование, сначала подготовив Т-клеточную среду, а затем стерилизовав ее, фильтруя ее через 0,45-микрометровый стерильный вакуумный фильтр, а затем с помощью стерильного вакуумного фильтра 0,22 микрометра. В день стимуляции Т-клеток или нулевой день, до стимуляции, мыть CD3/CD28 бусы, поместив необходимый объем бисера в стерильной 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки и повторно в один миллилитр ТКМ. Поместите трубку в контакт с магнитом в течение одной минуты.Затем аспирировать ТКМ и повторно в один миллилитр свежего ТКМ мыть бисер снова и повторить в общей сложности три моет. И, наконец, повторно помыть бисер в один миллилитр ТКМ. После подсчета Т-клеток, передать бисер т-клеток в соотношении трех к одному бисера к клеткам.Затем разбавить клетки до конечной концентрации одного миллиона клеток на миллилитр и инкубировать при 37 градусах по Цельсию, 5%CO2 в течение 24 часов. После приобретения конструкции CART19 в лентивирусном векторе, выполните лентивирусное производство с помощью первой инкубационные лентивирусные плазмиды, вектор упаковки, вектор конверта, прекомплексирующий реагент, трансфектонный реагент и трансфектную среду при комнатной температуре в течение 30 минут. Проведение лентивирусной работы с использованием BSL2'precautions, включая капюшоны клеточной культуры, средства индивидуальной защиты и дезинфекцию использованных материалов отбеливателем перед утилизацией.После инкубации добавьте эти трансфектные реагенты в 293 Т-клетки, которые достигли 70-90% слияния и культуры трансфицированных клеток при 37 градусах Цельсия и 5%CO2. В течение 24 и 48 часов после трансфекции, урожай, центрифуга, фильтр и концентрат, содержащий вирус супернатант ультрацентрифугации и заморозить при температуре минус 80 градусов по Цельсию для использования в будущем. В первый день, мягко повторного T-клеток, которые были стимулированы на один миллион клеток на миллилитр в день нуля, с тем чтобы разбить розетки клеток.В соответствии с соответствующими мерами предосторожности BSL2, добавьте свежий или замороженный собранный вирус в смоделированные Т-клетки при множественности инфекции 3.0. Продолжайте инкубировать трансдуцированные Т-клетки при 37 градусах Цельсия, 5%CO2. В дни три и пять, рассчитывать CAR-T клеток и добавить свежие предварительно разогретых TCM в культуру для поддержания концентрации CAR-T клеток одного миллиона клеток на миллилитр.Через шесть дней после моделирования, удалить бисер из транс индуцированных Т-клеток путем первого сбора урожая и повторного перерасхода клеток. Перенесите клетки в 50 миллилитровых конических трубок и поместите трубки в магнит на одну минуту. После сбора CAR-T-клеток, содержащих супернатант и отбрасывая бисер, место клетки обратно в культуре в концентрации одного миллиона клеток на миллилитр в культуре колбу.Используйте образец клеток для цитометрии потока для оценки поверхностного экспрессии CARs. Инкубировать остальные, чтобы возобновить расширение, а затем урожай и крио-сохранить клетки на восьмой день, как описано в рукописи. Чтобы нарушить гранулоцитов макрофаг колонии стимулирующий фактор, используйте руководство РНК, как описано в рукописи.Инкубация трансфектных реагентов при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации, добавить их к 293 Т-клеток, которые достигли 70 до 90% слияния и культуры трансфицированных клеток при 37 градусов по Цельсию, 5%CO2 для производства лентивируса. В 24 и 48 часов, урожай и концентрат, содержащий вирус супернатант ультрацентрифугации в 50 миллилитров ультрацентрифуг трубки и заморозить при температуре минус 80 градусов по Цельсию для использования в будущем.Затем в первый день, осторожно повторно Т-клеток, чтобы разбить розетки. В лаборатории, одобренной BSL2, для генерации клеток CAR-T, добавьте lentivirus CAR19 и GMCSF-таргетинга CRISPR лентивируса для моделируемых Т-клеток. На третий день и пятый день для успешно трансдуцированных lentiCRISPR-редактируемых Т-клеток, несущих устойчивость пуромицина, лечить клетки с пуромицин дигидрохлоридом при концентрации одного микрограмма пуромицина на миллилитр.Приливное секвенирование было использовано для подтверждения сокращения GM-CSF в GM-CSF нокаутом CART19 клеток с эффективностью нарушения примерно 71%Flow участков CAR-T поверхности поверхности окрашивания закрыты на живых CD3-положительных клеток показывают, что как дикий тип CART19 и GM-CSF нокаутОМ CART19 успешно и аналогичным образом выразить рецептор поверхности ЦАР в пробирке. С другой стороны, внутриклеточное окрашивание ГМ-CSF по цитометрии потока также закрыто на живых CD3-положительных клетках демонстрирует снижение экспрессии ГМ-CSF в нокаут-клетках по сравнению с клетками дикого типа CART19, подтверждающими функциональный успех нокаута. Особое внимание следует принимать во время трансдукционных этапов этой процедуры, поскольку они являются наиболее важными для развития генетически модифицированных клеток CAR-T.Описанная методология потенциально может быть применена к различным генам для модификации клеток CAR-T с помощью CRISPR/CAS9, чтобы помочь создать менее токсичный и более эффективный продукт. Технология CRISPR/CAS9 предоставляет стратегии непосредственной таргетинга генома клеток CAR-T на разработку решений текущих клинических недостатков.

using-crisprcas9-to-knock-out-gm-csf-in-car-t-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Исследования рака

В видео описывается процесс создания генетически модифицированных CAR-T-клеток с помощью системы CRISPR-Cas9. Инфицирование Т-клеток лентивирусами CRISPR и CAR приводит к модификации гена-мишени и синтезу химерного антигенного рецептора или CAR, что в конечном итоге приводит к образованию генетически модифицированных CAR-T-клеток.

Генетическая модификация CAR-Т-клеток с помощью системы CRISPR-Cas9

Это видео демонстрирует анализ для выполнения редактирования генов в Т-клетках человека с использованием технологии CRISPR-Cas9. Смесь первичных CD4+ и CD8+ Т-клеток сочетается с рибонуклеопротеиновым комплексом CRISPR-Cas9, нацеленным на определенные гены для нокаута. При электропорации sgRNA направляет Cas9 к целевой последовательности ДНК, создавая точные разрезы. Эти порезы затем восстанавливаются с помощью негомологичного механизма соединения концов клетки, что приводит к нокауту гена.

Метод CRISPR-Cas9 для редактирования генов в Т-клетках

Целевых генов редактирования с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 значительно облегчило понимание биологических функций генов. Здесь мы используем методологию ТРИФОСФАТЫ/Cas9 модель calreticulin мутации в cytokine зависимых гемопоэтических клеток с целью изучения их онкогенного действия.

С помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена, редактирования для изучения онкогенных активность мутантов Calreticulin в зависимых Cytokine гемопоэтических клеток

Протокол для быстро ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной гена срывов в мышь и гемопоэтических клеток человека основных описанных в этой статье. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins вводятся через электропорации с sgRNAs, порожденных через в vitro транскрипция и коммерческих Cas9. Высокая эффективность редактирования достигаются с ограниченного времени и финансовых затрат.

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Обычные потери функции исследования генов с помощью маскирования животных часто были дорогостоящим и трудоемким. Электропорация основанный ТРИФОСФАТЫ опосредованной соматических мутагенеза является мощным инструментом, чтобы понять, что ген функционирует в естественных условиях. Здесь мы приводим метод для анализа нокаут Фенотипы пролиферирующих клеток мозжечка.

ТРИФОСФАТЫ опосредованной потери функции анализа в мозжечковой грануле клеток с помощью в утробе матери на основе электропорации перенос генов

Здесь мы представляем протокол редактирования генов в первичных Т-клетках человека с использованием технологии CRISPR Cas для модификации CAR-T-клеток.

Производство человеческих CRISPR-инженерных CAR-T-клеток

Новые стратегии для точного моделирования соматических мутаций в гемопоэтических стволовых и прародительных клетках (HSPC) необходимы для лучшего изучения биологии гемопоэтических стволовых клеток и гематологических злокачественных новообразований. Здесь описан протокол моделирования гетерозиготных мутаций усиления функции в HSPC путем сочетания использования CRISPR/Cas9 и двойной донорской трансдукции rAAV.

Инженерные онкогенные гетерозиготные мутации усиления функции в гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках человека

В этой статье мы опишем метод избирательного изменения экспрессии генов в сосудистом сплетении, избегая при этом какого-либо воздействия на другие области мозга.

Направленный нокдаун генов в сосудистом сплетении

В статье описан протокол применения in vitro модели истощения для завершения полногеномного скрининга нокаута CRISPR в Т-клетках здорового донорского химерного антигенного рецептора.

Проведение полногеномного скрининга CRISPR in vitro в Т-клетках химерного антигенного рецептора

Мы разработали оптимизированный протокол нокаут-скрининга CRISPR-Cas9 для первичных Т-клеток CAR. За счёт снижения переноса gDNA через ферментативное переваривание и pulldown кассет sgRNA позволяет минимизировать артефакты ПЦР, обеспечивая точное обнаружение sgRNA и надёжную идентификацию функциональных генных мишеней.

Улучшение экранов CRISPR-Cas9 в CAR T-клетках: усовершенствованный метод подготовки библиотек

Узнайте генетическую модификацию CAR-T клеток с помощью CRISPR/Cas9 для повышения эффективности и снижения токсичности иммунотерапии рака. Этот метод оптимизирует производство клеток.

Использование CRISPR/Cas9 для выбивания GM-CSF в клетках CAR-T

Больше видео