Объединенные ГЕНЕТИЧЕСКИе экраны на основе CRISPR в клетках млекопитающих

Экранированные экраны ДЛЯ отсева CRISPR предоставляют исследователям простой, эффективный и недорогой метод допроса цепной функции на уровне генома. Преимуществом CRISPR является его ответственность редактировать любой ген, просто изменив последовательность руководства. Библиотеки руководств CRISPR позволяют исследователям объективно, систематически допрашивать весь геном любого организма в ходе одного эксперимента.

В настоящее время экраны CRISPR используются для выявления основных генов в сотнях случаев рака человека и для карты генетических взаимодействий. Экраны могут также всесторонне профиль наркотиков выявить лекарственные механизмы действия. Библиотеки CRISPR, описанные здесь, нацелены на человеческие клетки.

Тем не менее, направляные библиотеки, ориентированные на другие виды, такие как мышь, доступны и могут быть проверены аналогичным образом. Выполнение генома всей экраны в клетках человека может быть сложной на практике, так как она включает в себя обработку десятков миллионов в клетках и требует анализа больших наборов данных. Перед запуском экрана убедитесь, что линии ячейки тщательно характеризуются.

Это включает в себя знание чистоты вашей клеточной линии, удвоение времени, эффективность трансдукции лентивируса и чувствительность к агентам по отбору антибиотиков. Визуальная демонстрация даст представление о том, как практически обрабатывать миллионы ячеек, необходимых на экране, и систематически отслеживать тысячи возмущений. Демонстрация процедуры будет Андреа Хабсид, Kamaldeep Aulakh, и Райан Climie, все техники из моей лаборатории.

Начните с преобразования готовой плазмиды CRISPR sgRNA в электрокомпетентные клетки и выращивая их в соответствии с рукописными указаниями. Когда готовы к сбору колоний, добавить семь миллилитров LB с карбенициллином к каждой пластине и соскребать колонии с распространители клеток. Используйте 10-миллилитровую пипетку для переноса царапинных клеток в стерильную однолитровую коническую колбу и промыть пластину пятью миллилитров LB карбенициллином.

Опять же, перенесите полоскающий раствор в колбу. Центрифуга клетки в соответствии с рукописными указаниями, а затем, определить вес мокрой гранулы. Очистить плазмидную ДНК с помощью комплекта плазмидной очистки maxi или Mega.

Подготовка клеток для трансфекции путем посева 293 Т-клеток и инкубации их на ночь. На следующий день приготовьте три плазминные смеси трансфекции для 15-сантиметровых пластин. Рассчитайте количество плазмиды, необходимое для одной трансфекции, и сделайте смесь плазмидов для количества пластин, плюс одна, которые будут трансфицированы.

Затем подготовьте липидный трансфектонный реагент для каждой трансфекции и с пониженным количеством средств сыворотки в отдельные 1,5-миллилитровые микроцентрифуги для количества пластин, которые будут трансфицированы. Добавить реагент трансфекции, аккуратно перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. После инкубации добавьте ДНК в трансфектный реагент при соотношении реагентов трансфекции к микрограммам ДНК-комплекса.

Смешайте раствор осторожно и оставьте при комнатной температуре на 30 минут. Добавьте трансфектную смесь в упаковочные ячейки и инкубировать их в соответствии с рукописными указаниями. В день вирусного сбора урожая, проверить клетки для ненормальной и сплавленной морфологии, как признак хорошего производства вируса, и урожай лентивируса путем сбора супернатанта и передачи его в стерильной центрифуги трубки.

Начните с выбора руководства CRISPR РНК-библиотеки покрытия, которые будут поддерживаться по всему экрану. Основываясь на библиотечном охвате, определите количество клеток, необходимых для его поддержания на направляющий РНК, и количество клеток, необходимых для инфицирования в МВД 0.3. Затем определите количество пластин, необходимых для настройки инфекции, а затем, урожай и семена клеток на каждой тарелке.

Добавьте бромид гексадиметрина ко всем пластинам и добавьте необходимый объем вируса для скрининга и контроля двух пластин. Не добавляйте вирус для контроля одного. Замените этот том на мультимедиа.

Тщательно смешайте пластины, наклонив и поместите пластины в инкубатор, убедившись, что они находятся на уровне. Урожай инфицированных клеток в соответствии с рукописными указаниями и собирать три репликации клеточных гранул из объединились клетки для геномной извлечения ДНК. Центрифуга клетки на 500 раз g в течение пяти минут и мыть их с PBS.

Этикетка труб и заморозить сухой ячейки гранулы при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Разделите пул зараженных ячеек на три группы репликации, убедившись, что для поддержания библиотечного покрытия в каждой репликации. Семя клеток при плотности, которая обычно используется при их расширении.

Используйте одинаковое количество ячеек для каждой репликации и одинаковое общее количество ячеек между репликациями. Продолжайте прохождение клеток и собрать три репликации клеточных гранул из каждой репликации объединились инфицированных клеток до 15 до 20 клеток удвоения. На каждом проходе, урожай клеток из всех пластин в каждой репликации друг с другом.

Этикетка каждой гранулы со временем и репликации обозначения. Настройка PCR1 в соответствии с рукописными указаниями с в общей сложности 100 микрограммами геномной ДНК на 3,5 микрограмма геномной ДНК на 50-микролитровую реакцию и создать идентичные 50-микролитровые реакции для достижения желаемого охвата. Настройка одной реакции ПЦР трубки в соответствии с рукописными указаниями.

Используйте пять микролитров объединяют продукт PCR1 в качестве шаблона и используйте уникальные комбинации индексных грунтовок для каждого отдельного образца, чтобы объединить образцы библиотеки секвенирования. После завершения ПЦР, запустить ПЦР трубки продукт на 2%agarose гель при низком напряжении в течение одного до 1 1 / 2 часа. Визуализуй продукт на синем световом трансиллюминаторе и подакцизный диапазон 200 базовых пар.

Очистить ДНК и измерить ее количество и качество как с помощью спектрофотометра, так и с помощью флюорометра. Идеальное руководство РНК библиотека должна иметь каждый руководство РНК представлены в аналогичных количествах. Секвенирование нового поколения может быть использовано для подтверждения того, что библиотека имеет жесткое распределение направляющих РНК.

Анализ точного отзыва может быть использован для оценки производительности экрана. Высокая провыполнения экрана должны восстановить большое количество основных генов на базовый фактор больше, чем шесть и ложное открытие скорость менее 5%Точность отзыва кривая должна иметь острый локоть и прямую линию к конечной точке. Фактор Байеса представляет собой меру уверенности в том, что ген нокаутом приводит к фитнес-дефекту.

Высокие баллы указывают на повышенную уверенность, в то время как низкие баллы свидетельствуют о том, что ген нокаут обеспечивает преимущества роста. Геном-широкий нокаут бассейны могут быть выучны в присутствии избыточного лекарственного агента для искать гены супрессорной устойчивости. Для выполнения положительного экрана отбора для супрессора тимидин блока, нормализованные считые отсчеты для всех направляющий выступ RNAs на T0 построены против mean-normalized отсчетов чтения для тимидин-обработанных образцов.

Ключевой деталью для успешного выполнения CRISPR экранов является поддержание хорошего распределения каждого направляющий РНК, начиная от трансфекции плазмиды и трансдукции клеток. Это сведет к минимуму вероятность случайных эффектов, которые могут исказить руководство РНК представление и привести к ложным положительным или отрицательным результатам. После проверки экрана, эксперименты должны быть сделаны для подтверждения хитов, потому что основной экран определяет только потенциальные хиты.

В зависимости от биологии хитов, различные методы могут быть использованы. Редактирование CRISPR в сочетании с секвенированием нового поколения позволило в различных системах моделей человека утратить функциональные экраны в масштабе генома. Из-за простоты CRISPR, эти типы экранов в настоящее время широко доступны для всех исследователей, что позволяет больше ученых использовать функциональные генетические методы для изучения биологических процессов и болезней.