Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии
19 февраля 2020 г.
В этой статье представлены методы подготовки образцов для уникального аналитического метода в реальном времени, основанного на спектрометрии окружающей среды. Этот метод позволяет нам выполнять в режиме реального времени анализ биологических молекул in vivo без каких-либо специальных предварительных процедур.
Таким образом, это уникальная эмбиентная масс-спектрометрия, особенно подходящая для анализа биологических образцов, как in vitro, так и in vivo. Поскольку это не требует регулярной предварительной обработки образцов, таких как сортировка клеток, фракционация и концентрация, он может анализировать образец с минимальной потерей биологических компонентов, особенно тех, которые существуют как очень небольшое количество. Этот метод позволяет анализировать сырье непосредственно в минуту с помощью масс-спектрометрии.
Быстрота заключается в надежности системы, главных преимуществах, присущих этой технике. Все, что вам нужно сделать, это просто подготовить кремнезем, 10 миллиграммов образцов тканей, и 10 микролитров размножаться. И положить их в одноразовый картридж.
Он установлен на машину PESI-MS, и вы получите результат в течение нескольких минут. Выбрав соответствующий масс-спектрометр, можно аннотировать молекулярную идентичность. Для начала извлечения печени или почечной ткани из морозильной камеры.
На пробковой пластине, вырезать образец ткани примерно на два на два миллиметра с помощью скальпеля или ножа. Кроме того, пробить образец с Trepan и обрезать длину колонны до двух миллиметров. Если ткань загрязнена кровью, промойте ее ледяным фосфатно-буферным солевым раствором.
Поместите около 10 миллиграммов вырезанного или проборезаного образца в пластиковую микротрубку и добавьте 100 микролитров 50% этанола. Используйте микропестл для гомогенизации образца. Затем с пипетщиком поместите 10 микролитров гомогената в колодец картриджа масс-спектрометра.
Поместите картридж в ионизационные камеры масс-спектрометра Direct Probe Ionization и установите зонд иглы из нержавеющей палочки, который будет использоваться для ионизации образца. Закройте крышку камеры твердо, чтобы автоматически активировать устройство безопасности. Запустите бортовой компьютер, нажав значок старта для анализа, используя экранные панели, применить напряжение 2,3 киловольты к игле для создания электроспрей и убедитесь, что частота иглы составляет три герц.
Подождите 30 секунд, пока измерение будет завершено. После измерения каждого образца, утилизировать картридж и иглу в биоопасных утилизатора. Для анализа масс-спектров откройте программное обеспечение, связанное с масс-спектрометром.
Нажмите на файл L-C-D в окне браузера файла данных программного обеспечения. Выбор нажмите на один пик окна массового спектра, и автоматически изобразить E-I-C. Проверьте T-I-C и E-I-C, и нажмите на значок среднего спектра, чтобы выбрать диапазон времени окно для генерации спектра массы.
Экспорт данных массового спектрального текста. Чтобы проанализировать жидкости организма, нарисуйте до 10 микролитров образца сыворотки и раздайте его в микротрубку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте в трубку 190 микролитров 50%этанола, затем вихрь в течение двух минут при комнатной температуре.
Чтобы устранить все эритроциты, центрифуга жидкости при 15000 раз G в течение одной-пяти минут при четырех градусах цельсия. Перенесите 10 микролитров супернатанта в колодец картриджа и приступайте к измерению на масс-спектрометре, как и раньше. Этот протокол показывает подготовку образца для PESI-MS на твердом образце, жидком образце, и живом животном.
Карцинома почечных клеток человека показывает характерные пики нейтральных липидов. Были относительно сильные пики в спектрах при соотношении массы к заряду 900 от ткани почечной клетки человека, которые не были выявлены в окружающих нераковой ткани. Эти пики в основном представляют собой триатилглицерол.
Пример данных, полученных в нормальных тканях печени, изображал неопластическое поражение у пациента с хроническим гепатитом и циррозом печени. Человеческая сыворотка от трех особей была проанализирована с помощью PESI-MS, были явные различия в спектральных моделях среди индивидуумов. При метаболических изменениях в 5-ФЗ, внутривенно вводимых в хвостовой сосуд мыши, в печени на месте было достигнуто очень быстрое и чувствительное обнаружение 5-ФЗ с натрием аддука.
Как глубина кончика иглы от места ткани, играет наиболее важную роль в ионизации, которая читает успешное получение данных, убедитесь, что следовать инструкциям. Вы можете определить молекулярный вид, заи взглядом в коммерческую базу данных. Это способ квалифицировать молекулярный механизм заболевания.
Многие исследователи заинтересовались применением этого метода для прогнозирования процветания болезни и ее прогноза. Особенно с помощью биопсии Рикет. Просто убедитесь, что не кололи иглой зонда.
Этого можно просто избежать с помощью конкретного инструмента для удаления иглы из машины.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен уникальный метод масс-спектрометрии окружающей среды для анализа биологических образцов in vivo в режиме реального времени. Эта методика позволяет анализировать необработанные ткани без специальной предварительной подготовки, что минимизирует потерю биологических компонентов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Масс-спектрометрия
- Биологический анализ
- Аналитическая химия
Введение
- Масс-спектрометрия с ионизацией в открытом пространстве подходит как для анализа in vitro, так и in vivo.
- Данный метод не требует сложной предварительной подготовки образцов.
- Он позволяет анализировать образцы с минимальными потерями биологического компонента.
- Высокая скорость анализа является ключевым преимуществом этого метода.
Цель исследования
- Представить метод анализа биологических молекул в режиме реального времени.
- Продемонстрировать эффективность анализа необработанных тканей.
- Осветить преимущества использования масс-спектрометрии окружающей среды.
Используемые методы
- Подготовка образцов кремнезема и тканей.
- Использование одноразовых картриджей для анализа образцов.
- Прямой анализ биологических образцов методом масс-спектрометрии.
- Быстрая обработка образцов в течение одной минуты.
Основные результаты
- Метод позволяет проводить быстрый анализ без значительной потери компонентов.
- Он эффективен для анализа образцов с очень малым количеством биологического материала.
- Демонстрирует стабильность и надежность при анализе в режиме реального времени.
- Облегчает изучение биологических молекул в их нативном состоянии.
Выводы
- Масс-спектрометрия с ионизацией в открытом пространстве является ценным инструментом для биологического анализа.
- Данный метод углубляет понимание биологических процессов.
- Он предлагает быстрый и эффективный способ анализа в режиме реального времени.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением с помощью зонда (PESI-MS) позволяет проводить молекулярный анализ биологических образцов в режиме реального времени с минимальной предварительной подготовкой, что способствует быстрому подтверждению мишеней и снижению рисков при изучении механизмов действия на ранних этапах поиска. Данный метод требует всего 10 mg ткани или 10 µL сыворотки, что делает его подходящим для малообъемных доклинических образцов и снижает потерю биологических компонентов. Эта возможность повышает достоверность прогнозов при идентификации соединений-лидеров, предоставляя прямые данные о динамике метаболитов и лекарственных средств in situ в живых системах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем обнаружения нейтральных липидов и метаболитов непосредственно в твердых тканях, таких как почечно-клеточный рак.
- Практическая ценность: требует минимальной подготовки проб — только гомогенизации ткани в 50% этаноле, что снижает сложность и вариативность рабочего процесса.
- Прогностическая ценность: способствует подтверждению молекулярных механизмов путем сопоставления с коммерческими базами данных, что помогает в оценке достоверности мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет проводить прямой анализ сыворотки крови человека после простого осаждения этанолом и центрифугирования, что обеспечивает возможность скрининга биомаркеров в жидкостных средах.
- Практическая ценность: использование одноразовых картриджей и зондов из нержавеющей стали обеспечивает стандартизацию и снижает риск перекрестного загрязнения.
- Масштабируемость: способствует быстрому обороту образцов — получение результатов за несколько минут — что обеспечивает готовность к высокопроизводительному скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: позволяет отслеживать динамику метаболитов или лекарственных препаратов в конкретных органах живых животных в режиме реального времени, например, детектировать 5-FdU в печени мыши.
- Механистическое снижение рисков: обеспечивает получение молекулярных данных in situ без разрушения тканей, сохраняя физиологический контекст для более эффективного трансляционного перехода от доклинических к клиническим исследованиям.
- Продвижение с учетом рисков: позволяет выявлять спектральные паттерны, связанные с заболеванием (например, неопластические поражения при циррозе печени), что служит основой для принятия решений о целесообразности дальнейшего продолжения исследований.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Метод PESI-MS встраивается в континуум открытий — от ранних биологических исследований до идентификации соединений-лидеров, обеспечивая быстрый количественный молекулярный анализ, который способствует проверке гипотез и подготовке методов анализа.
- Поисковая биология: Обеспечивает проверку гипотез путем обнаружения тканеспецифичных молекулярных сигнатур (например, триацилглицерола при карциноме) без фракционирования.
- Скрининг: Позволяет проводить анализ жидкостей и тканей, готовых к анализу, с помощью стандартизированного ввода образцов на картриджах.
- Аналитика: Формирует масс-спектральные данные (пики m/z, EIC, TIC) для количественного сравнения различных условий и индивидуумов.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты с доклинической валидацией путем мониторинга метаболитов лекарств in vivo, например, при внутривенном введении 5-FdU в хвостовую вену мыши.
- Корпоративное использование: Предусматривает использование многоразового оборудования (зонд, камера) с одноразовыми расходными материалами, что обеспечивает стандартизацию между проектами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает неопределенность механизмов за счет получения прямых молекулярных данных из неповрежденных биологических систем.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированной подготовке образцов (10 mg ткани, 10 µL сыворотки, 50% этанола) и фиксированным настройкам напряжения/частоты (2.3 kV, 3 Hz).
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейших исследований (go/no-go) за счет возможности быстрого обнаружения метаболитов/лекарственных средств в моделях заболеваний.
- Влияние на портфель исследований: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков путем выявления специфических для заболевания пиков (например, m/z 900 при карциноме), которые отсутствуют в контрольных образцах.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с масс-спектрометром, включая приготовление растворителей (50% этанола) и использование центрифуги для обработки сыворотки.
- Необходим масс-спектрометр с прямой ионизацией (Direct Probe Ionization Mass Spectrometer) с совместимой системой картриджей и игловидным зондом из нержавеющей стали.
- Требуется межлабораторная стандартизация процедур обработки образцов — нарезки тканей, гомогенизации и переноса супернатанта — для обеспечения согласованности данных.
- Необходимо учитывать глубину погружения кончика иглы как критическую переменную, влияющую на эффективность ионизации и качество данных при применении in vivo.
- Метод ограничен образцами, совместимыми с ионизацией при атмосферном давлении; для сложных биожидкостей может потребоваться оптимизация с учетом матричных эффектов.
