Количественная оценка динамики взаимодействия белков с использованием мультиплексного со-иммунопрециации
August 21st, 2019
Количественный мультиплекс иммунопрецитификации (ЗМИ) использует поток цитометрии для чувствительного обнаружения различий в изобилии целевых белково-белковых взаимодействий между двумя образцами. ЗМИ может быть выполнена с использованием небольшого количества биоматериала, не требует генетически модифицированных тегов, и может быть адаптирована для любой ранее определенной сети взаимодействия белка.
Количественная мультиплексированная ко-иммунопреципиентация, или ЗМИ, позволяет пользователям одновременно измерять сотни бинарных взаимодействий в предопределенной сети взаимодействия белка. Выполняя несколько со-IPs одновременно в том же лизе, биоинформатики методы могут затем изучить, как группы совместного объединения изменения в скоординированной основе. Анализ отнимая много времени на разработку, но как только панель qMI находится в руке, данные сетевого масштаба могут быть собраны о системах передачи сигналов в относительно просто ночном анализе.
«МИ требует точного пипетки различных образцов и реагентов в 96 пластин. При настройке и запуске каждого анализа следует принимать осторожные заметки для предотвращения ошибок. Для подготовки образца и иммунопреципиентации, начните с облизывания образца в подходящем моющее средство с ингибиторами протеазы и фосфатазы в течение 15 минут инкубации на льду.
В конце инкубации, спина вниз образца для удаления мембран и мусора и выполнить анализ BCA на супернатант, чтобы определить концентрацию белка в соответствии со стандартными протоколами. После нормализации концентрации белка, подготовить магнитный шарик мастер смесь, которая содержит около 250 магнитных бусин каждого класса на колодец. Используйте магнитное разделение для мытья магнитной смеси шарика два раза в буфере Fly P, прежде чем повторно использовать бисер в 20 микролитров буфера Fly P на образец.
После тщательного пипетки, aliquot 20 микролитров бисера в одну ледяную микроцентрифугную трубку на образец и добавить равные объемы лизата с нормализованными концентрациями белка в каждой трубке для иммунопреципиентации. Затем разделите каждый образец лизата на одну трубку для каждой запущенной пластины и проясните образцы на ротаторе при четырех градусах Цельсия, защищенных от света. На следующее утро используйте магнитную стойку шарика, чтобы удалить лизат из первого набора трубок и мыть бисер два раза в 500 микролитров ледяной Fly P буфера за стирку.
После расчета объема повторного получения, повторное использование иммунопрециатов в расчете объема ледяного буфера Fly P. Тщательно resuspend магнитные бусины нежной пипетки и распространять 25 микролитров бисера на колодец через плоский дном 96 хорошо пластины на льду. В другой пластине 96 хорошо, разбавленный attinilated антителами зонда к 2 временам работая концентрации.
Используйте многоканальный пипетку для распределения 25 микролитров каждого зонда антитела разбавления в соответствующие скважины магнитной шарик, содержащий анализ пластины и встряхнуть на высокой скорости на горизонтальной шейкер пластины смешивать и повторно магнитных бусин. После смешивания, уменьшить скорость в течение одного часа инкубации на четыре градуса по Цельсию защищены от света. В конце инкубации, мыть пластину три раза со свежим буфером Fly P на стирку на магнитной шайбе пластины при четырех градусах по Цельсию.
После последней стирки, повторно использовать бисер в 50 микролитров стрептавидина PE разбавленной от одного до 200 в буфере Fly P. Встряхните смесь и повторно поместите шарики перед инкубацией пластины при четырех градусах По Цельсию в течение 30 минут, защищенных от света. В конце инкубации трижды вымойте пластину буфером Fly P на шайбе магнитной пластины при четырех градусах по Цельсию и повторно помесив бисер в 125 микролитров буфера Fly P.
Встряхните тарелку в течение одной минуты при 900 вращениях, чтобы тщательно повторно использовать бисер и загрузить пластину в рефрижерированный цитометр потока. В программном обеспечении цитометра потока выберите параметр High RP1 Target, состояние остановки 1000 бусин на область и объем выборки 80 микролитров. Пауза запустить на полпути через и повторно beads для предотвращения урегулирования.
В конце запуска экспортировать файлы данных в формате XML. Для выполнения анализа АНК заполните входной файл АНК, чтобы отразить детали экспериментального проектирования и запустить программу, которая напишет файл CSV в активный каталог. Файл, заканчивающийся хитами.
csv сообщит о со-ассоциациях протеина которые значительно друг на ложноположивном уровне 0.05 между управлением и экспериментальными условиями в по крайней мере 3 из 4 экспериментальных репликаций. Для взвешенного анализа сети корреляции вставьте заголовки столбца вывода файла данных Matlab, заканчивающийся в mfi. csv в первую колонку новой таблицы и добавить столбцы Эксперимент для эксперимента номер и лечение для экспериментального лечения и любых других переменных, которые будут проанализированы.
Сохраните этот файл в качестве признаков. csv и открыть R Studio. Установите рабочий каталог на папку, содержащую мфо.
csv и черты. csv файлы, выделить разделы кода, и ударил Команды Введите для запуска команд R, как указано в прокомментировал командный файл. Взвешенные модули сетевого анализа корреляции, значительно коррелированные с каждой экспериментальной чертой, будут выводиться в качестве графического файла, а корреляция каждого взаимодействия с каждым модулем будет выводиться в качестве файла CSV.
Для каждого взаимодействия в файле вывода АНК определите, является ли это взаимодействие также значительным CNA, и создайте новую колонку, которая указывает, является ли каждый удар АНК также хитом CNA. Преобразование значений для изменения двухкратных раз и расчета среднего значения для всех хитов CNA профсоюза АНК. Наконец, сделайте новую таблицу с каждым хитом профсоюза АНК CNA, перечисленным его целью иммунопреципиентации в одной колонке, ее целью зонда во второй колонке и значением изменения складок в третьей колонке.
Импорт этого файла в Cytoscape как сеть для создания диаграммы кромки узла. Взаимодействия белков высокой уверенности, выявленные двумя независимыми статистическими подходами, визуализируются как диаграммы кромок узла с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом Cytoscape или в качестве тепловых карт с использованием R-кода и инструкций по анализу, включенных в дополнительный материал. На протяжении всего протокола, пользователи должны заботиться, чтобы пипетки точно, вести тщательный учет, и держать образцы холодной во все времена.
Мы использовали МИ, чтобы понять, как пути трансдукции сигнала различают различные типы входных данных и интегрируют информацию из нескольких рецепторов.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Количественная мультиплексная соиммунопреципитация (QMI) позволяет одновременно измерять множество взаимодействий белок-белок в рамках определенной сети. Этот метод эффективен, требует минимального биоматериала и не требует генетически модифицированных меток.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Клеточная биология
Бакграунд
- QMI позволяет обнаруживать различия в взаимодействиях белков между образцами.
- Ассей можно адаптировать для различных сетей взаимодействий белков.
- Это позволяет собирать данные масштаба сети о системах передачи сигналов.
- Точное пипетирование и настройка имеют решающее значение для предотвращения ошибок.
Цель исследования
- Измерить бинарные взаимодействия в беловых сетях.
- Анализировать, как коассоциации меняются в координированной манере.
- Разработать надежный ассе для изучения сложных биологических систем.
Используемые методы
- Одновременная соиммунопреципитация в 96-лунковых пластинках.
- Лизис образцов с использованием подходящих детергентов с ингибиторами.
- Биоинформатические методы для анализа данных.
- Ночные ассеи для сбора данных.
Основные результаты
- QMI обеспечивает чувствительное обнаружение взаимодействий белков.
- Облегчает изучение сложных сигнальных путей.
- Позволяет высокопроизводительный анализ беловых сетей.
- Демонстрирует эффективность мультиплексирования в иммунопреципитации.
Выводы
- QMI является мощным инструментом для изучения взаимодействий белков.
- Он упрощает процесс анализа сложных биологических данных.
- Будущие применения могут распространиться на различные области исследований.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) enables biopharma R&D teams to simultaneously measure hundreds of binary protein interactions within a defined network, providing network-scale insights into signal transduction dynamics. By eliminating the need for genetic tagging and requiring minimal biomaterial, QMI supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery workflows. The method generates quantitative fold-change data that can be analyzed using independent statistical approaches (ANC and WGCNA) to increase predictive confidence in protein co-associations relevant to therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying fold changes in protein interactions across experimental conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation without genetic manipulation, preserving native protein complexes.
- Predictive Value: Increases confidence in target selection through coordinated changes in co-associations detected by dual statistical validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative, fluorescence-based readouts of Proteins in Shared Complexes (PiSCES) for reproducible interaction profiling.
- Operational Value: Uses MagBead spectral regions to multiplex immunoprecipitations, enabling parallel processing in 96-well format.
- Scalability Value: Adaptable to any defined protein interaction network, supporting reuse across projects and model systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Generates hypothesis-ready data from T cell and neuronal glutamate synapse networks, with direct relevance to immune and neurological disease areas.
- Mechanistic De-risking: Identifies condition-specific interaction changes that inform pathway modulation strategies.
- Preclinical Continuity: Outputs node-edge diagrams and heatmaps that visualize high-confidence interactions for downstream validation.
Pipeline & Workflow Integration
QMI fits within the discovery continuum from target engagement screening to lead optimization, providing interaction network context that informs compound mechanism of action and selectivity profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how groups of co-associations change in response to stimuli or perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative interaction data suitable for hit confirmation and pathway elucidation.
- Analytics: Enables comparison of interaction strengths via log2 fold change and statistical significance (FDR < 0.05) across replicates.
- Translational Research: Connects discovery-phase interaction dynamics to disease-relevant systems such as immune synapses and neuronal signaling.
- Enterprise Reuse: Once developed, the QMI panel allows repeated overnight assays, reducing per-experiment time and reagent burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through quantitative, multiplexed interaction measurements.
- Operational Value: Standardizes complex co-IP workflows using magnetic bead separation and flow cytometry readout.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by de-risking mechanistic assumptions early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on network-level interaction dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody validation, magnetic bead handling, and flow cytometry optimization.
- Dependent on access to a refrigerated flow cytometer capable of multiplexed bead region detection.
- Necessitates standardized lysis buffer optimization and careful protein normalization across samples.
- Involves multi-day assay development including antibody screening, bead conjugation, and probe biotinylation.
- Limited to soluble protein complexes; may not capture transient or membrane-embedded interactions without optimization.
