Человек жировой ткани микро-фрагментации для клеточного фенотипирования и секретома характеристики

Используя эту систему, мы можем собирать субмиллиметровые скопления жировой ткани человека, в которых цела вся микроокантиния регенеративных клеток. Вся микрососудистая система также не повреждена, и поэтому мы можем использовать такого рода микроохвасти для трансплантации in-vivo для экстракорпорального развития культуры и для изоляции клеток для дальнейшей характеристики. Основным обоснованием использования системы в исследовательской лаборатории является то, что этот процесс полностью без ферментов, и поэтому он позволяет быстрой и эффективной обработки жировой ткани человека при сохранении микро-архитектуры, и это будет микроваскулярно ткани полностью нетронутыми.

И поэтому мы можем непосредственно изучить клеточный продукт терапии, который оказался уже очень полезным в клинике. Эта технология закрытой системы является простым в использовании методом для сбора урожая, обработки и повторной инъекции рафинированной жировой ткани внутриоперационной, и может быть успешно применена в косметике ортопедии, проктологии, а также гинекологии. Этот метод позволяет продолжить изучение влияния жира на регенерацию тканей.

Процедура будет продемонстрирована Бьянка Vezzani, аспирант и Марио Гомес-Салазар, который является аспирантом. Работая в асептических условиях в течение 16 часов после сбора урожая, поместите образец абдоминопластики поверх хирургической ткани с кожей вверх. Используйте одноразовую канюлю инфильтрации тканей, чтобы ввести 50-100 миллилитров 37 градусов по Цельсию 0,9% раствор хлорида натрия в подкожной жировой ткани.

Подключите 10-миллилитровый шприц luer lock к одноразовой липосакционной канюле и схвяв образец в кижной области вблизи края образца, аккуратно ввяйте канюлю в жировую ткань. После того, как канюла находится внутри ткани, извлечь поршень и переместить канюлю радиально в образец жировой ткани. Важно, чтобы справиться с жировой ткани твердо во время липо-аспирации.

Если не хватает жира собирается, рассмотреть вопрос о выполнении дополнительных солевые инъекции. Когда шприц полон липо-аспирата, тщательно удалить канюлю из ткани и заменить полный шприц с новым пустым шприцем, пока в общей сложности 60 миллилитров аспирата был собран. Для микро-фрагментации липо-аспирата удалите устройство из упаковки и убедитесь, что основной блок подключен к мешою отходов.

Поместите мешок для сбора отходов на землю и убедитесь, что клапаны закреплены на колпачках процесса. Пирс мешок соединения порта для подключения терминала всплеск входной линии в солевой мешок и положение солевой мешок выше, чем процессинговый блок. Убедитесь, что все пять зажимов, подключенных к трубам цепей, открыты, поместите процессинговый блок в вертикальное положение, позвольте солевым раствором заполнить блок обработки и подтвердите, что поток достигает мешка отходов.

Встряхните блок обработки, чтобы удалить любые пузырьки воздуха и поместите устройство в вертикальное положение с синей крышкой, обращенной вверх. Закройте зажим рядом с входной линией и соедините шприц липо-аспирата с самоохожающий клапан синей входной крышки, чтобы начать вводить липо-аспират. Сохраняя вертикальный блок обработки, медленно нажимаем вниз на поршень шприца до тех пор, пока весь липо-аспират не будет передан в устройство.

Когда все липо-аспират был введен, откройте входной зажим для восстановления солевого потока и энергично встряхнуть процессинговый блок, по крайней мере две минуты, регулярно проверяя солевой раствор потока в мешок отходов. Когда солевой раствор в блоке обработки становится прозрачным, поместите устройство с серой крышкой вверх и закройте зажимы, расположенные на стоке рядом с синими и серыми колпачками. Обработанная ткань будет плавать в верхней части.

Затем заполните 10-миллилитровый шприц Luer lock солевым раствором и соедините шприц с погрузочным клапаном синей крышки. Подключите пустой 10-миллилитр Luer блокировки шприц с поршень полностью вставляется в клапан серой крышкой. Твердо ввините солевой раствор в процессинговый блок из синей крышки, проверяя, что шприц, подключенный к серой клапану, следовательно, заполняется обработанной тканью.

Когда все солевой раствор был введен, тщательно удалить оба шприца и повторить солевой настой, пока все обработанные ткани были собраны. В конце обработки удалите все шприцы, закройте все зажимы, отсоедините солевой мешок и утилизировать устройство в соответствии с местными протоколами. Когда все обработанные ткани были собраны, передать микро-фрагментированных жировой ткани в стерильный контейнер, и добавить равный объем пищеварения среды в контейнер.

Поместите запечатанный контейнер в 37 градусов по Цельсию встряхивая водяной бане, установить до 120 оборотов в минуту в течение 45 минут, останавливая пищеварение с равным объемом блокирующего раствора в конце инкубации. Последовательно фильтровать образец, сначала через 100 микрометровый ситечко клетки следуют фильтрации через 70 микрометровых клеток ситечко и центрифуги фильтрованной подвески в течение пяти минут при 200 раз g. Мы приостанавливаем гранулы примерно в 5 миллилитров буфера лиза эритроцитов в течение 15 минут при комнатной температуре.

Остановите лиз с равным объемом блокирующего раствора и отфильтруйте раствор через 40-метровый клеточный ситечко. Затем соберите микро-фрагментированные клетки жировой ткани путем центрифугации, и мы приостанавливаем гранулы в свежем блокирующего растворе с мукой-смешиванием для подсчета. После диссоциации и окрашивания антителами, микро-фрагментированные жировые клетки могут быть доставлены в цитометр потока для анализа клеток и/или сортировки.

Механическая диссоциация ручных липоаспиратов приводит к выработке микрофузной жировой ткани, которая состоит из совокупности адипоцитов, окутывающих микрососудикулярную сеть. Иммунофлюоресценция анализа желатина встроенных в криофиксированных микро-фрагментированных жировой ткани подчеркивает структуру, показывая сосудистой сети отмечены эндотелиальной клеточной маркер Ulex Europaeus Agglutinin 1 рецептор и в основном состоит из небольших капиллярных как сосуды. Примечательно, что перициты, выражаюющие нейронно-глиальный антиген 2 или бета-рецептор фактора роста, получаемый тромбоцитами, обычно распространяются, окутая эндотелиальные клетки.

Исключая CD31 положительные эндотелиальные и CD45 положительные гематопоэтические клетки, наличие CD146 положительных CD34 отрицательных перицитов и CD146 отрицательных и CD34 положительных адвентитиальных клеток могут быть определены в рамках MAT. Ручная липо-аспирации является важной частью процедуры и должна быть выполнена в стерильных условиях не более чем через 16 часов после абдоминопластики. Микро-фрагментированные жировой ткани могут быть дополнительно обработаны иммуногистохимического окрашивания, в пробирке культуры или секретом анализа, чтобы получить более глубокое понимание биологии жировой ткани.

Этот метод позволяет изучать различные ткани в их естественном, родном, трехмерном расположении как своего рода небольшие органоиды, которые достаточно малы, чтобы быть пересаженными у мышей или поддерживаться в долгосрочной культуре. И мы используем эту систему главным образом для экспериментального подхода к различным микроокнониям, специфичным для органов. Наши доноры жировой ткани не известны как носители трансмиссивных инфекций.

Однако при отсутствии какого-либо дальнейшего скрининга все человеческие ткани следует рассматривать как потенциально загрязненные и обработанные соответствующим образом.