Мышиная модель инфекции спинальных имплантатов in vivo

Послеоперационная инфекция является разрушительным осложнением операции на позвоночнике. Эта мышиная модель инфекции спинального имплантата позволяет исследователям изучать влияние хозяина, имплантата и терапевтических факторов на инфекцию. Этот метод количественно оценивает продольную бактериальную нагрузку в режиме реального времени, гуманно и эффективно, in vivo.

Используя замороженный бульон S.aureus zen 36, поместите бактерии на бульонные пластины Luria, содержащие 200 микрограммов канамицина на миллилитр, и инкубируйте в течение 12-16 часов при температуре 37 градусов Цельсия. В конце инкубации индивидуально культивируют единичные колонии из культуры S.aureus zen 36 в триптическом соевом бульоне, содержащем 200 мкг на миллилитр канамицина, в течение 12-16 часов при 37 градусах Цельсия и 200 оборотах в минуту. На следующий день разведите культуру в свежем бульоне в соотношении один к 50 и культивируйте бактерии в течение еще двух часов, чтобы обеспечить выделение бактерий среднелогарифмической фазы.

В конце инкубации гранулируйте бактериальные клетки центрифугированием и трижды промойте клетки в одном миллилитре свежего PBS за одну промывку. После последней стирки измерьте впитывающую способность на уровне 600 нанометров. Идеальная оптическая плотность составляет 0,750.

Затем повторно суспендируйте бактерии в соотношении 10 до трети колониеобразующих единиц на два микролитра концентрации PBS. Используйте машинки для стрижки волос с крестца и верхней части грудного отдела позвоночника 12-недельного самца мыши C-57 black six. Введите обезболивающее лекарство с помощью подкожной инъекции непосредственно перед подготовкой кожи и повторите через три дня.

Простерилизуйте операционное место с помощью трех чередующихся бетадиновых и спиртовых салфеток. После третьего протирания поместите мышь в положение лежа на стерильное хирургическое ложе и максимально напрягите бедра. Перед тем, как сделать разрез, подтвердите отсутствие реакции на защемление пальца ноги.

Пальпируйте гребень подвздошной кости примерно до тела поясничного отдела четырех позвонков и с помощью лезвия хирургического скальпеля No 15 сделайте продольный разрез кожи в два сантиметра. Пальпируйте остистый отросток, чтобы подтвердить среднюю линию, и продолжайте разрез вниз до кости. Рассекайте субпериостально с правой стороны L-4 остистого отростка, распространяющегося латерально к поперечному отростку, и пропустите открытый рассасывающийся плетеный шов размера 5,0 цефалада и хвост к телу L-4 через фасцию.

С помощью спинальной иглы 25-го калибра рассверлите остистый отросток L-4 и вставьте L-образный хирургический имплантат из нержавеющей стали диаметром 0,1 миллиметра и длиной один сантиметр вдоль пластинки, с укладыванием цефалады на длинную руку. Инокулируйте имплантат в количестве от 10 до трети колониеобразующих единиц на два микролитра биолюминесцентного S.aureus zen 36, следя за тем, чтобы весь раствор контактировал с имплантатом. Немедленно завяжите шов, чтобы обеспечить удержание инокулюма на имплантате, и используйте второй рассасывающийся шов, чтобы закрыть кожу бегущим образом.

Поместите мышь на грелку с контролем до полного восстановления. Получите послеоперационные рентгенограммы для подтверждения правильной установки имплантата. Чтобы измерить бактериальную нагрузку, в соответствующий день после заражения с помощью машинки для стрижки удалите все отросшие волосы от крестца до верхней части грудного отдела позвоночника и поместите мышь на биолюминесцентную платформу для визуализации.

Используя большие настройки изгиба с полем зрения 13 сантиметров, улавливайте биолюминесцентный сигнал в течение пяти минут. Затем используйте программное обеспечение для биолюминесцентной визуализации, чтобы изолировать стандартную яйцевидную область, представляющую интерес, чтобы количественно определить средний и максимальный общий поток биолюминесценции. В соответствующей экспериментальной конечной точке, после подготовки мыши, как показано для хирургической процедуры, используйте лезвие скальпеля номер 15 для резкого разреза старого разреза и используйте стерильные ножницы для тупого рассечения до L-4 остистого отростка.

Когда имплантат будет идентифицирован, с помощью игловодителя осторожно скрутите и снимите имплантат с его места, а затем с помощью стерильных щипцов и ножниц соберите примерно один грамм остистой кости и мягких тканей, непосредственно окружающих хирургический имплантат. Поместите ткань в один миллилитр PBS в предварительно взвешенную маленькую коническую трубку носорога, содержащую четыре острых гомогенизирующих бусины, и поместите имплантат в 250 микролитров 0,3%TWEEN 80 в соевом бульоне триптих. Взвесьте пробирку с тканью и используйте гомогенизатор для гомогенизации образца.

Вонзайте имплантаты со средней прочностью в течение двух минут, затем обрабатывайте их ультразвуком в течение 10 минут. Разбавьте имплантат в образцах тканей один к 10, один к 101, один к 1000 и поместите их на пластины триптиха из соевого бульона, содержащие 1% агара. Поместите тарелки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на ночь.

На следующий день подсчитайте колониеобразующие единицы из имплантата и окружающих тканей. Инфицированные контрольные мыши демонстрируют сигналы BLI, которые достигают пика на 10-й день после заражения и остаются выше одного умноженного на 10-5 фотонов в секунду на квадратный сантиметр на теридиан до тех пор, пока не принесут жертву, успешно моделируя хроническую инфекцию спинального имплантата. Мыши, получавшие монотерапию ванкомицином, демонстрировали значительно более низкий сигнал BLI по сравнению с инфицированной контрольной группой, с двукратным снижением с 10-го по 21-й день после заражения.

После 21-го дня после инфицирования не наблюдалось существенной разницы в БЛЖ между монотерапией и инфицированной контрольной группой. Мыши, получавшие комбинированную терапию ванкомицином и рифампицином, имели еще более низкий сигнал BLI, который в 20 раз ниже, чем у инфицированных контрольной группы на 10-й день после заражения. Это значительное снижение сохраняется до 28-го дня после заражения, после чего существенной разницы в БЛЖ не наблюдается ни между одной из групп.

Имплантаты и окружающие ткани, собранные и обработанные на 35-е сутки, не выявили существенных различий в колониеобразующих единицах между группами инфицированного контроля, монотерапии и комбинированной терапии. После этой процедуры иммунный ответ хозяина также может быть изучен, например, с использованием мышей с флуоресцентно меченными нейтрофилами. Разработка этой эффективной мышиной модели позволила нам определить новые эффективные методы лечения инфекции спинальных имплантатов.