Выявление ингибиторов взаимодействия HBx-DDB1 с помощью системы сплит-люциферазы

Взаимодействие HBX-DDB1 является важным шагом для содействия транскрипции ВПЧ от cccDNA, так что этот протокол может стать ключевым активом, чтобы обнаружить новые терапевтические агенты для функционального лечения ВПЧ. Наша процедура проста и требует лишь короткого времени для проверки. Взаимодействие, которое я смешиваю, может быть обнаружено в режиме реального времени, не требуя лиза клеток.

Кроме того, качество скрининга является удовлетворительным с высоким й премьер-оценки. Ингибирование взаимодействия HBX-DDB1 приводит к восстановлению Smc5/6, что приводит к подавлению транскрипции ВПЧ, экспрессии белка и производства cccDNA. Этот новый механизм противовирусного действия может преодолеть недостатки современных методов лечения ВПЧ.

Белково-белковые взаимодействия являются важным классом лекарственных целей. Описанная здесь кислота на основе сплит-люциферазы, которая нацелена на взаимодействие между вирусными и hasS белками, может стать новой стратегией разработки лекарств от других инфекционных заболеваний. Хотя наш протокол прост и прост для понимания, некоторые шаги может быть трудно воспроизвести без визуальной демонстрации.

Таким образом, визуальная демонстрация будет большим подмогают понять наш протокол. Начните с посева пять раз от 10 до 5 HEK293T клеток в 100 миллиметров блюдо с 10 миллилитров DMEM, и инкубации их на ночь при 37 градусов по Цельсию. На следующий день разбавляют по одному микрограмму каждого из HBx-LgBit и SmBit-DDB1, выражая плазмиды ДНК и буфер конденсации ДНК на общий объем 300 микролитров.

Добавьте 16 микролитров раствора усилителя и смешайте трубки вихрем в течение одной секунды. Инкубировать образец при комнатной температуре в течение трех минут, затем добавить 60 микролитров трансфектного реагента. Вихрь трубки в течение 10 секунд, и инкубировать образец в течение еще восьми минут.

Между тем, аспирировать средний от блюда с клетками и мыть их с пятью миллилитров ПВХ. Аспирировать PVS и добавить семь миллилитров DMEM. Добавьте три миллилитров DMEM в трубку с трансфектными комплексами, пипетку вверх и вниз, чтобы смешать, и добавить смесь в клетки.

Затем инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию и пятипроцентный углекислый газ в течение 10 часов. После инкубации удалите отращенную культурную среду и вымойте клетки пятью миллилитров ПВХ. Удалите ПВХ на один миллилитр 0,25%трипсина ЭДТА, и инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию, чтобы отделить их.

Затем добавьте четыре миллилитров DMEM и разойдите среду, несколько раз пролив ее по поверхности клеточного слоя, и перенесите подвеску в трубку. Центрифуга клетки на 500 раз G в течение пяти минут, а затем отказаться от супернатанта, и повторно приостановить ячейки гранулы в один миллилитр ПВХ. Повторите цетифугуцию и отбросьте супернатант.

Затем повторно приостанавливайте клеточные гранулы буферной клеточной культурой среды, дополненной 10%FBS к плотности посева в один миллион клеток на миллилитр. Pipette 50 микролитров клеточной подвески в каждый колодец 96-хорошо пластины, и вернуть клетки в 37-градусный-по Цельсию инкубатор в течение 10 часов. В то время как клетки инкубации, разбавить скрининг соединений и растворителя до 13,5 Х концентрации.

Добавьте 12,5 микролитров люминесцентного субстрата к каждому колодец и инкубировать пластину в течение пяти минут при комнатной температуре. Измерьте базовую люминесценцию с помощью люминометра и добавьте пять микролитров соединений и контролируемых DMSO к каждому из них сразу после этого. Измерьте люминесценцию каждые 30 минут в течение двух часов, затем рассчитайте ингибирующее воздействие соединений по сравнению с лечением DMSO.

Были измерены базовые сигналы люминесценции, а соотношение сигнала к фону было рассчитано более чем на 80. Прайм был больше 0,5, что указывает на то, что эта система анализа приемлема для скрининга с высокой пропускной способностью. Установив порог более чем на 40% ингибирование по сравнению с DMSO только контроль, нитазоксанинид был определен в качестве кандидата наркотиков.

Ранее мы определили нитазоксанинид как ингибитор взаимодействия HBX-DDB1, скрининг реактивности мелкомасштабной библиотеки соединения с помощью этого метода. Используя нитазоксанин, мы подтверждаем, что ингибирование взаимодействия HBX-DDB1, что снижение вирусной транскрипции, и последующие уровни вирусного продукта. Оптимальная часть сплит-люциферазы, слитой с целевым белком, должна быть определена заранее.

В этом случае HPX срослась с большим битом на C-конечных процессорах HPX и DDB1, слитых с Small Bit в конце срока DDB1 при условии, что лучшие результаты.