Характеристика Exon Пропуск эффективность в DMD пациент образцов в клинических испытаниях антисенс олигонуклеотидов
7 мая 2020 г.
Здесь мы представляем молекулярную характеристику экспрессии дистрофина 38 с помощью секвенирования Сэнгера, RT-PCR и западного блата в клинических испытаниях.
Этот протокол содержит стандартизированную методологию подготовки и обработки мышечной ткани в доклинических условиях и клинических испытаниях, что важно для получения надежных результатов в области DMD. Методы актуальны для exon пропуска tryouts для DMD. И главное преимущество в том, что они хорошо зарекомендовали себя и воспроизводимы, если осуществляться коллективно.
Эти методы в основном сосредоточены на exon пропуска в DMD, но с изменением грунтовки, те же методы могут быть применены к другим заболеваниям, обработанным сращивания терапии. Эти методы могут быть использованы для достижения экзон пропуская эффективность как РНК и белка. Чтобы подготовить образец для анализа, сначала смешайте равные объемы трагакантовой резинки и воды, пока жвачка не станет мягкой и липкой.
Загрузите эту смесь в 25 миллилитровых шприцев и вылейте от 0,5 до одного сантиметра жвачки на отдельные пробковые диски. Этикетка дисков на противоположной стороне и поместите контейнер изопентан в жидкий азот, пока некоторые из жидкости замерзает. Поместите каждый образец в трагакантовую резинку на дисках с продольной оси каждой мышцы перпендикулярно пробке.
Поместите резинку вокруг в нижней части каждой мышцы, чтобы помочь держать мышцы на месте, и использовать пинцет, чтобы заморозить образцы в холодной изопентан. Перемещение образцов непрерывно в течение одной минуты или до полного замораживания, прежде чем поместить их временно на сухой лед. Затем поместите образцы в стеклянные флаконы для хранения 80 градусов по Цельсию.
Для раздела замороженных мышечной ткани для анализа, установить криостат к рабочей температуре 25 градусов по Цельсию, и смонтировать мышечный блок на держатель. Обрежьте блок ткани до тех пор, пока не будут достигнуты плоские секции. Для обратной транскриптазы ПЦР и западного анализа помарки, получить 10 микрометров толщиной ломтиками.
Для иммуногистохимического анализа, получить от шести до восьми микрометров толщиной ломтиками, а для гематоксилина и эозина окрашивания, получить от 10 до 12 микрометров толщиной ломтиками. После их приобретения поместите нарезанные секции в две миллилитровые трубки. Храните образцы для ПЦР и западной blotting при 80 градусов по Цельсию.
Здесь показаны система электрофореза микрочипа, гель-изображения реакций обратной транскриптазы ПЦР и результаты секвенирования пропущенной полосы от двух пациентов до и после лечения антисенс-олигонуклеотидом в фазе эскалации дозы первого исследования. Оба пациента гавани удаления. Как и ожидалось, перед лечением, оба пациента показали, не пропуская и только не пропустил полоса может быть визуализирована.
После 12 недель лечения, четкая пропущенная нижняя полоса была визуализирована для второго пациента, однако, было все еще трудно обнаружить любой пропущенный продукт для первого пациента. Результаты секвенирования показали конкатенацию экзонов 47 и 54 для второго пациента, и экзонов, 44 и 54 для первого пациента. Для расчета пропущенного процента концентрация моляров для пропущенной полосы была разделена пропущенными и неотрековатыми полосами.
Как и ожидалось, до начала лечения западной помарки не было обнаружено ни одной дистрофии. После лечения, полоса была обнаружена у второго пациента с более низким молекулярным весом по сравнению с тем, что наблюдается в здоровом контроле. Первый пациент, однако, не показал никаких обнаруживаемых уровней дистрофина после лечения.
Очень важно правильно обрабатывать мышечную ткань и последовательно поставить каждый образец на трагакантовую резинку. Разделы тканей могут быть проанализированы различными способами, в том числе искусственные ПЦР, цифровой ПЦР, Западная помарка, иммуногистохимия, и с различными типами омиков. Эти методы могут быть ускорены, развитие, дополнительные exon пропуск наркотиков ориентации различных экзонов, и могут быть применены к разработке вирусных основе и снова в редактировании для DMD.
Обзор
В данном исследовании представлена стандартизированная методология подготовки и обработки мышечной ткани в клинических исследованиях, связанных с мышечной дистрофией Дюшенна (МДД). Основное внимание уделено методам пропуска экзонов, которые имеют решающее значение для разработки эффективных методов терапии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Клинические исследования
Теоретическая часть
- Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) представляет собой тяжелое заболевание, сопровождающееся атрофией мышц.
- Пропуск экзонов является перспективным терапевтическим подходом при МДД.
- Надежная работа с тканями необходима для получения точных результатов экспериментов.
- Стандартизированные методы могут повысить воспроизводимость исследований.
Цель исследования
- Установить надежный протокол подготовки мышечной ткани.
- Обеспечить возможность проведения испытаний по пропуску экзонов при DMD.
- Создать основу, применимую к другим заболеваниям, которые лечатся методами терапии сплайсинга.
Используемые методы
- Подготовка мышечной ткани с использованием трагакантовой камеди и изопентана.
- Заморозка и секционирование образцов мышц для анализа.
- ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинг для определения экспрессии дистрофина.
- Секвенирование для анализа эффективности пропуска экзонов.
Основные результаты
- Успешная визуализация пропущенных полос у пациентов, прошедших лечение.
- Обнаружение дистрофина у одного пациента после лечения.
- Вариабельность ответа на лечение у разных пациентов.
- Подчеркнута важность единообразного обращения с тканями для получения точных результатов.
Выводы
- Стандартизированные методы имеют решающее значение для развития терапии DMD.
- Пропуск экзонов демонстрирует потенциал, но требует дальнейшей оптимизации.
- Будущие исследования могут опираться на эти методы для более широкого применения.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный протокол устанавливает стандартизированный рабочий процесс для оценки эффективности пропуска экзонов в образцах пациентов с DMD, что напрямую способствует валидации мишени при разработке антисмысловых олигонуклеотидов. Обеспечивая количественное измерение молекулярного восстановления, этот метод позволяет снизить механические риски для терапии по пропуску экзона 53, такой как вилтоларсен. Данный подход повышает прогностическую уверенность при переходе от доклинических к клиническим исследованиям за счет установления связи между биохимическими показателями и терапевтическим механизмом.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать пропуск экзонов, опосредованный антисмысловыми олигонуклеотидами, в качестве терапевтической гипотезы на образцах, полученных от пациентов.
- Практическая ценность: предоставляет воспроизводимые методы секвенирования по Сенгеру, ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга для подтверждения целевой молекулярной активности.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные показатели соотношения пропущенных полос к общему количеству полос для оценки зависимости эффективности пропуска экзонов от дозы.
- Практическая ценность: стандартизирует протоколы подготовки и срезания тканей для обеспечения воспроизводимости анализа в наборах доклинических и клинических образцов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает анализ систем, значимых для заболевания, путем характеристики восстановления дистрофина в реальных биопсийных образцах мышц пациентов.
- Практическая ценность: Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет использования согласованных молекулярных показателей в различных модельных системах.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум процесса разработки от валидации мишени до идентификации ведущего соединения, обеспечивая молекулярное подтверждение механизма перед тестированием функциональной эффективности.
- Биология открытий: подтверждает целевую коррекцию сплайсинга экзонов в образцах пациентов, что служит основанием для проверки гипотез об антисмысловых олигонуклеотидах.
- Скрининг: обеспечивает количественное определение процента пропуска экзонов с помощью гель-визуализации и секвенирования, что позволяет сравнивать соединения.
- Аналитика: обеспечивает количественную оценку пропущенных полос на основе молярной концентрации для сравнительного анализа различных доз и пациентов.
- Трансляционные исследования: связывает молекулярный пропуск экзонов с детекцией белка дистрофина, соединяя механизм на уровне РНК с результатом на уровне белка.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую систему обработки и анализа тканей, применимую к нескольким целевым экзонам и методам терапии сплайсинга.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Механистическое снижение рисков за счет прямой визуализации пропуска экзонов и восстановления дистрофина в тканях человека.
- Операционная ценность: Стандартизированное заливание в трагакантовую камедь и криосеционирование обеспечивают однородность образцов и снижают вариабельность.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя молекулярные доказательства взаимодействия с мишенью до достижения функциональных конечных точек.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию антисмысловых олигонуклеотидов с поправкой на риск на основе эффективности пропуска экзонов для соответствующих генотипов пациентов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами молекулярной биологии, включая ОТ-ПЦР, вестерн-блоттинг и секвенирование по Сэнгеру.
- Необходим криостат для изготовления срезов тканей, а также жидкий азот/изопентан для быстрого замораживания.
- Требуется соблюдение стандартизированных протоколов обработки тканей для сохранения целостности образцов в разных центрах или в разные моменты времени.
- При разработке праймеров для детектирования пропуска экзонов необходимо учитывать вариабельность мутаций у конкретных пациентов.
- Метод ограничен полуколичественным характером гель-электрофореза без валидации с помощью цифровой ПЦР или капиллярного электрофореза.
