OaAEP1-опосредованный ферментативный синтез и иммобилизация полимеризованного белка для одномолекулярной силовой спектроскопии

Наш энзиматический метод использует белковый олигомер с контролируемым количеством степени полимеризации. Это идеальный образец подготовки для одной молекулы силы спектроскопии исследования, а также на основе белка материал строительства. Наш метод не вводит цистеин в целевой белок.

Поскольку цистеин является одним из наиболее важных функциональных остатков белка, он облегчает строительство полимеризованного белка вещества или ферментов. Демонстрация процедуры будет Yibing Дэн и Shengchao Ши, аспирантов из моей лаборатории. Для начала растворите 20 граммов хромата калия в 40 миллилитров ультрачистой воды в стакане.

Медленно добавьте 360 миллилитров концентрированной серной кислоты в раствор дихромата калия и используйте стеклянный стержень для мягкого перемешивания. Поместите стеклянную крышку в хромическую кислоту и перенесите ее в духовку при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Очистите крышку водой, а затем абсолютный этиловый спирт и высушите крышку потоком азота.

Полностью погрузите крышку в 1%-й объем по объему раствора ТОЛУОЛА APTES в течение одного часа при комнатной температуре, защищая их от света. Вымойте крышку с толуолом, а затем с абсолютным этиловый спирт и высушить крышку с потоком азота. Инкубировать крышку при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 15 минут, а затем дайте ему остыть до комнатной температуры.

Используйте пипетку, чтобы добавить 200 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр Sulfo-SMCC в растворе DMSO между двумя обездвиженными крышками и инкубировать в течение одного часа, защищенного от света. Через час сначала вымойте крышки с помощью DMSO, а затем абсолютным этиловый спирт, чтобы удалить остаточный Сульфо-SMCC. Высушите крышку под потоком азота.

Пипетт 60 микролитров 200 микромоляных GL-ELP-50 цыс-белковый раствор на функционализированный крышку и инкубировать при 25 градусах по Цельсию в течение примерно трех часов. После этого промойте крышку ультрачистой водой, чтобы удалить неотредактированный GL-ELP-50-cys. Чтобы подготовить функционализированную поверхность кантилевера, сначала погрузите кантилеверы в хромированную кислоту и очистите кантилеверы при 80 градусах по Цельсию в течение 10 минут.

Используйте воду и абсолютный этиловый спирт, чтобы смыть кислоту. Погрузите кантилевер с 1%-ным объемом по объему раствора ТОЛУОЛА APTES для выполнения засолинизации аминокислот в пластиковой крышке трубки в течение одного часа. Промыть кантилевер абсолютным этиловый спирт, а затем выпекать кантилевер при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 15 минут.

Погрузите кантилевер в раствор Sulfo-SMCC в течение одного часа, а затем промойте кантилевер абсолютным этиловый спирт. Чтобы связать cys-ELP-50-NGL с поверхностью, погрузите кантилеверы в cys-ELP-50-NGL с малеймидной группой Сульфо-SMCC в течение 1,5 часов. Затем смойте неотредактированную cys-ELP-50-NGL на кантилевере ультрачистой водой.

Затем погрузите функционализированный кантилевер в раствор, содержащий 200 микролитров 50 микромолящих белковых растворов GL-CBM-XDockerin с 200 наномолярными OaAEP1 и поместите их при 25 градусах Цельсия в течение 20-30 минут. Затем используйте буфер AFM, чтобы смыть неотредактированный белок. Очень важно смыть неотредактированный остаточный белок перед экспериментом AFM, потому что он сформирует пары сцепления докерина и блок кантилевера, чтобы взять новый белок на поверхности.

Чтобы связать слаженность блока лигации-T-L-белок интереса-NGL с GL-ELP-50 обездвиженным на поверхности крышки, добавьте 15 микролитров OaAEP1 на крышку и дайте ему инкубировать в течение 30 минут. Используйте от 15 до 20 миллилитров буфера AFM, чтобы смыть любые неотредактированные белки. Добавьте 100 микролитров протеазы TEV, чтобы расщепить белковый блок на месте распознавания TEV в течение одного часа при 25 градусах цельсия.

Затем используйте от 15 до 20 миллилитров буфера AFM, чтобы смыть остаточные белки. Связать связующим устройством сплочения-T-L-белок интереса-NGL с стеклом GL-ubiquitin-NGL от OaAEP1 в течение 30 минут. В зависимости от белков конструкций GL-ubiquitin-NGL, которые будут построены на стеклянной поверхности, повторите шаги полипротеина подготовки n1 раз.

Опустить последнюю реакцию расщепления TEV на резервную сплоченность на белковом полимере в качестве сцепления-TEV-L-ubiquitin-n-NGL стекла. Добавьте один миллилитр буфера AFM с 10 миллимолярный хлорид кальция и пять миллимолярной аскорбиновой кислоты в камеру жидкости AFM. Выберите D кончик функционализированного зонда AFM для эксперимента.

Погрузите зонд в буфер AFM. Убирай кантилевер с постоянной скоростью 400 нанометров в секунду с поверхности. В то же время, записывают кривую расширения силы со скоростью выборки 4000 герц.

Используйте теорему экипировки для калибровки кантилевера в буфере AFM с точным пружинным постоянным значением K перед каждым экспериментом. Прикрепите кончик кантилевера, функционируют с докерином, к отложенной на хранение поверхности, функционально функционально функционируют с сплоченностью, чтобы сформировать пару сплоченности-докерина. Затем откройте программное обеспечение для обработки данных JPK и выберите кривую расширения силы с характерным шаблоном, похожим на пилу, и высокой силой отряда.

В этом исследовании остатки NGL, введенные между соседними белками при перевязке OaAEP1, не повлияли на стабильность белка мономера в полимере, выраженную в том, что разворачивающаяся сила и шагом противодлиной длины были сопоставимы с предыдущим исследованием. Очистка феррикальной формы рубредоксин представил типичные УФ-визуализированные пики поглощения на 495 нанометров и 575 нанометров, в то время как цинковая форма этого не сделала. SDS-страница гель результаты шаг за шагом пищеварения и перевязки показывают сплоченный TEV-L-убиквитин, в результате белковой смеси расщепления TEV, чистый GFP-TEV-протеаза, и очищенный продукт GL-ubiquitin.

Показаны также расщепленная смесь перевязки GL-ubiquitin и cohesin-TEV-L-ubiquitin с OaAEP1 или без нее и чистый OaAEP1. Очень важно функционализировать поверхность с помощью активного Сульфо-SMCC для успешного пептидного крепления. Здесь мы предоставляем новый метод построения полимеризованного белка.

Это облегчает исследователям изучение сложной белковой системы с использованием одномекулярной спектроскопии силы. Хроматическая кислота сильно коррозионна и кислая. Будьте осторожны, когда вы готовите и обрабатывать его.