Адаптируемый угловой стереотаксический подход для универсальных методов нейробиологии

Этот протокол имеет большое значение, поскольку он представляет собой адаптируемую стереотаксическую процедуру, которая может быть использована как на мышах, так и на крысах, и может быть применена ко многим новым нейронаучным методам. Основным преимуществом этой адаптируемой стереотаксической процедуры является ее возможность использования для воздействия на сложные и труднодоступные области мозга. Демонстрировать процедуру будет Челси Фабер, молодой, талантливый научный сотрудник лаборатории.

Убедившись, что рама и микроманипулятор откалиброваны, поместите центральный измеритель высоты в гнездо опорной пластины держателя головки. Закрепите центрирующий эндоскоп в держателе инструмента и прицельтесь вниз. Отрегулируйте положение микроманипулятора до тех пор, пока перекрестие не будет выровнено и сфокусировано на перекрестии датчика, и поместите ушные планки в держатели так, чтобы линии индикатора с обеих сторон были на нуле.

Используйте медиально-латеральную и передне-заднюю ручки на держателе для головы, чтобы центрировать ушные планки в плоскостях X и Y над перекрестием центрального измерителя высоты. Чтобы выровнять положение ушного вкладыша по оси Z, снимите ушные вкладыши с держателя и извлеките центральный измеритель высоты. Затем замените ушные планки и снова отцентрируйте полосы в положении нуля.

Затем снова посмотрите на эндоскоп и используйте ручки вертикального сдвига и наклона короны соответственно, чтобы опустить и повернуть ушные планки до тех пор, пока перекрестие прицела не останется по центру между ушными раковинами на протяжении всего коронального вращения. Чтобы выровнять центральную ось вращения по угловым координатам, закрепите центрирующий эндоскоп в держателе инструмента и расположите микроманипулятор по рассчитанной координате. Обратите внимание, что правая/левая координата для наклонной имплантации соответствует длине стороны А. Прицеливаясь в эндоскоп, отметьте эту координату, чтобы обозначить точку, в которой канюля войдет в мозг после поворота головки.

Переместите микроманипулятор над средней линией и с помощью ручки наклона коронки поверните головку на рассчитанный угол. Если перекрестие прицела не совпадает с контрольной меткой, с помощью вертикальной ручки переключения передач отрегулируйте положение головы по оси Z до тех пор, пока перекрестие не выровняется как можно ближе к метке. В этой точке произвольная точка вращения должна быть выровнена по центру вращения стереотаксиса.

Поверните головку обратно в корональное положение с нулевым градусом, прежде чем приступить к последующим этапам сверления и микроинъекции. После выполнения микроинъекции верните головку в положение нулевого градуса и с помощью ручного сверла поместите два отверстия спереди и два отверстия сзади, достаточно далеко от расположенных под углом координатных отверстий для заусенцев, чтобы вместить часть ободка волоконно-оптического волокна, которая находится над черепом. Когда все отверстия будут просверлены, используйте небольшую плоскую отвертку, чтобы вставить костяные винты как можно аккуратнее, чтобы они прочно сидели в черепе, не проникая в мозг.

Зажмите оптоволоконную канюлю в держателе канюли и поместите держатель канюли в держатель инструмента. Поверните голову на рассчитанный угол, заметив, что координаты микроманипулятора не относятся к новому инструменту. Используйте центр угловых отверстий для заусенцев в качестве мишени для имплантации.

Опустите оптоволоконный кабель до тех пор, пока он не коснется твердой мозговой оболочки в центре отверстия для заусенцев, и обнулите микроманипулятор по оси Z. Медленно опустите волоконно-оптический кабель до дорсальной вентральной угловой координаты, затем используйте цианоакрилатный гель для соединения оптоволоконного наконечника с ипсилатеральными анкерными винтами. Используйте наконечник для микропипетки для нанесения ускорителя.

Как только гель полностью застынет, осторожно ослабьте и поднимите держатель канюли, пока он не освободится от наконечника. Вживите второй фиброоптический в координату под контрлатеральным углом, затем выровняйте головку. Для дополнительной безопасности используйте цианоакрилатный гель и ускоритель, чтобы сделать дополнительное соединение между двумя наклонными волоконно-оптическими канюлями, и нанесите небольшое, относительно тонкое количество стоматологического цемента на поверхность черепа, тщательно покрывая анкерные винты и основание волоконно-оптических канюль

Чтобы выяснить роль нейронов вентромедиального ядра гипоталамуса в гликемическом контроле, в этом репрезентативном анализе был использован стандартный, неугловой, стереотаксический подход для двусторонней микроинъекции вируса родопсина ингибирующего канала в вентромедиальное ядро. Учитывая близость вентромедиального ядра к срединной линии, пространственные ограничения не позволяли провести безугловую имплантацию билатеральной волоконной оптики, что потребовало разработки хирургической стратегии для точной имплантации волоконной оптики под углом. Самое важное, что нужно помнить, — это просто быть терпеливым и не торопиться, так как последовательность и точность в назначении координат имеет решающее значение для успеха.

Эта процедура может быть адаптирована и применена к любому нейробиологическому методу, требующему микроинъекции или имплантации в мозг грызуна, включая подходы химиогенетики, оптогенетики и фотометрии волокон.