Установка капиллярной электрофорезной индуктивно соединенной плазменной масс-спектрометрии (CE-ICP-MS) для количественной оценки видов железного редокса (Fe (II), Fe (III))
4 мая 2020 г.
Этот метод видообразования редокса железа основан на капиллярной электрофорез-индуктивно соединенной плазменной масс-спектрометрии с укладкой образца в сочетании с коротким анализом за один запуск. Метод быстро анализирует и обеспечивает низкие пределы количественной оценки для видов красного железа в различных тканях и биофлюидных образцах.
Чрезмерное железо приводит к свободному редокс-активного железа два с лишним, которые могут вызвать разрушительные последствия в клетке, такие как окислительный стресс и гибель клеток от перекисного окисления липидов известный как ферроптоз. Количественные измерения железа ферросуса и железа являются ключом к более внимательному пониманию этих пагубных процессов. Этот метод CE-ICP-Ms обеспечивает как быстрый анализ, так и низкие пределы количественной оценки, которые необходимы для количественной оценки видов железо-редокса.
Начните с выбора небулайзера с низким объемом самооспирации и подготовки соответствующих частей для установки домашнего интерфейса. Подключите два трехмерных женских сочных разъема с мужским конусом, подключив левый конец нижней полосы люэра к мужскому разъему и мужской разъем к среднему соединению верхнего трехголевого люэра. Затем поместите одну сантиметровую трубку над платиновой проволокой и используйте одну сантиметровую силиконовую трубку для подключения первой трубки и сопла мужского более люэрного разъема.
Зафиксив сборку к среднему соединению нижнего трехоборотного люэр-разъема путем вращения винта. Нажмите одну сантиметровую трубку над выходом капилляра CE и положение на восемь-девять сантиметров от конца, а затем подключить его к сопла мужской соляной разъем с силиконовой трубки. Положите всю сборку через бар верхнего трехоборотного разъема T и исправить мужской разъем люэра и левый конец женского трехоборотного люэра разъем винт вращения.
Затем зафиксировать 25-сантиметровую силиконовую трубку на сопле мужского люэра и зафиксировать всю сборку в нижней части бара от нижнего трехмерного разъема приманки. Плотно нажмите один сантиметр силиконовой трубки, пять миллиметров над концом небулайзера. В то время как второй мужской конус конус разъем подключен к выступающей части трубки.
Переместите часть интерфейса с выступающим ce капилляром к мужскому конусу на небулайзере, затем аккуратно вставьте капилляр через мужской конус и более широкую часть капилляра небулайзера. При необходимости отрегулируйте длину выступающего капилляра, отвинтив левую мужскую люэр, переверев люер с прикрепленными трубками в нужное положение и переустановив его. Верхние женские трехмерные сочные разъемы должны плотно прилегать к мужскому конусу.
По его завершения с установкой приступить к МСП-г-жа Кривые калибровки были созданы для железа три и железа двух видов redox. Пределы обнаружения составили 3,1 микрограмма на литр железа 2 и 3,2 микрограмма на литр для железа три и линейность была продемонстрирована до 150 микрограмм на литр.
Анализ SH-SY5Y Cell Lysate показал несколько более медленный миграцию видов редокса железа из-за несколько более высокой проводимости. Измеренные концентрации железа 3 и железа два составили 330 микрограмм на литр и 84 микрограмма на литр, соответственно. В результате железа два к трем соотношение 0,25.
Наиболее важным шагом этого протокола является тщательная вставка выступающей капиллярной CE через установленный интерфейс и его подходящее позиционирование, связанное с капилляром небулайзера. Представленные здесь методы могут стать перспективным инструментом углубления понимания железозависимых молекулярных процессов. Тщательно разработанные исследования необходимы для проверки, если железо два с лишним, железо три с лишним количественной оценки может служить в качестве потенциального биомаркера для выявления тканей, риску железа опосредованного смертельного повреждения в контексте нейродегенеративных и онкологических заболеваний.
Обзор
В данном исследовании представлен новый метод определения окислительно-восстановительных форм железа с использованием капиллярного электрофореза в сочетании с масс-спектрометрией с индуктивно-связанной плазмой (CE-ICP-MS). Этот метод обеспечивает возможность экспресс-анализа и низкие пределы количественного определения форм железа в различных тканях и биологических жидкостях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Аналитическая химия
Теоретические сведения
- Избыток железа может привести к окислительному стрессу и гибели клеток.
- Количественное измерение двухвалентного и трехвалентного железа имеет решающее значение для понимания этих процессов.
- Ферроптоз — это форма гибели клеток, связанная с перегрузкой железом.
- Существующие методы могут не обеспечивать необходимую скорость и чувствительность для количественного определения железа.
Цель исследования
- Разработать быстрый и чувствительный метод количественного определения форм железа в различных степенях окисления.
- Изучить значение количественного анализа железа при нейродегенеративных заболеваниях и раке.
- Подтвердить потенциал количественного определения железа в качестве биомаркера повреждения тканей.
Используемые методы
- Капиллярный электрофорез с индуктивно-связанной плазмой и масс-спектрометрией (CE-ICP-MS).
- Подготовка образцов с использованием самостоятельно собранного интерфейса.
- Калибровочные кривые для окислительно-восстановительных форм железа (II) и железа (III).
- Анализ лизата клеток SH-SY5Y для измерения концентрации железа.
Основные результаты
- Пределы обнаружения составили 3,1 µg/L для железа(II) и 3,2 µg/L для железа(III).
- Линейный отклик наблюдался при концентрациях до 150 µg/L.
- Измеренные концентрации составили 330 µg/L для железа(III) и 84 µg/L для железа(II).
- Отношение железа(II) к железу(III) составило 0,25.
Выводы
- Разработанный метод является перспективным для изучения железозависимых молекулярных процессов.
- Тщательная настройка оборудования имеет решающее значение для получения точных измерений.
- Необходимы дальнейшие исследования для изучения роли количественного определения железа в контексте заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Точный количественный анализ окислительно-восстановительных форм железа (Fe(II)/Fe(III)) имеет решающее значение для понимания механизмов повреждения клеток, опосредованных железом, в контексте нейродегенеративных и онкологических заболеваний. Метод CE-ICP-MS позволяет быстро и чувствительно обнаруживать эти формы в сложных биологических матрицах, что способствует раннему выявлению рисков при проверке механизмов терапевтических гипотез, связанных с окислительным стрессом и путями ферроптоза. Эта возможность расширяет возможности валидации мишеней, предоставляя количественные редокс-специфичные биомаркеры для сортировки портфеля проектов на этапе поиска новых лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать редокс-гомеостаз железа в качестве терапевтической гипотезы в моделях заболеваний.
- Практическая ценность: обеспечивает специфичные для редокс-состояния количественные показатели для уточнения механистических путей гибели клеток, индуцированной железом.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность выбора мишеней на основе биомаркеров путем корреляции соотношений Fe(II)/Fe(III) с окислительным стрессом и исходами ферроптоза.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Обеспечивает низкие пределы обнаружения (3,1–3,2 µg/L) и линейный отклик до 150 µg/L, что позволяет проводить надежное количественное определение в разбавленных лизатах и биожидкостях.
- Воспроизводимость: Демонстрирует прецизионность времени миграции <3% и прецизионность измерения 2,2–3,5%, что гарантирует стабильные результаты скрининга соединений.
- Масштабируемость: Стэкинг по проводимости и pH позволяет использовать более высокие объемы ввода проб без ущерба для разделения, что повышает производительность при валидации анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: позволяет измерять формы железа в различных степенях окисления в лизатах клеток SH-SY5Y и спинномозговой жидкости, связывая фундаментальные исследования с системами, релевантными для заболевания.
- Принятие решений с учетом рисков: точность восстановления (97–105%) и подтверждение методом стандартных добавок обеспечивают надежное количественное определение биомаркеров для критериев принятия решения «продолжать/остановить».
- Механистическое снижение рисков: облегчает оценку стратегий модуляции обмена железа, обеспечивая прямое определение видов Fe(II) и Fe(III) в доклинических моделях.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Метод CE-ICP-MS интегрируется в рабочие процессы раннего поиска, предоставляя специфические количественные данные о редокс-статусе, которые используются на этапах валидации мишеней и идентификации соединений-лидеров, особенно для путей, связанных с железозависимым окислительным стрессом.
- Открытия в биологии: обеспечивает проверку гипотез о нарушении регуляции обмена железа в моделях нейродегенеративных и онкологических заболеваний с помощью количественного определения с разрешением по видам химических форм.
- Скрининг: позволяет стандартизировать анализ за счет низкого предела количественного определения (LOQ) и высокой точности, что облегчает надежную оценку влияния соединений на окислительно-восстановительные состояния железа.
- Аналитика: генерирует количественные данные на основе площади пика и показатели времени миграции, что позволяет проводить сравнение различных условий и анализ тенденций.
- Трансляционные исследования: обеспечивает связь с доклинической валидацией посредством измерения видов железа в клеточных лизатах и биожидкостях, что способствует согласованию биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: детектирование с помощью ICP-MS, не зависящее от платформы, позволяет использовать метод для анализа множества других элементных мишеней, помимо железа, что повышает долгосрочную полезность.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: снижает неопределенность механизмов, разграничивая вклад Fe(II) и Fe(III) в окислительный стресс и ферроптоз.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимость за счет разделения с усилением за счет стэкинга и снижения помех в режиме DRC.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), предоставляя количественные редокс-биомаркеры, связанные с патологическими состояниями железа.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию соединений с учетом рисков на основе их влияния на специацию железа в моделях, релевантных для данного заболевания.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с установками для капиллярного электрофореза и оптимизацией ICP-MS, особенно в режиме DRC с использованием NH3 в качестве реакционного газа.
- Результат зависит от стабильности сборки интерфейса между капилляром КЭ и распылителем для сохранения целостности сигнала и предотвращения окислительно-восстановительных сдвигов.
- Необходима стандартизация параметров фонового электролита (20 mM HCl) и напряжения (+25 kV) между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости.
- Требуется адаптация для образцов с переменной проводимостью (например, СМЖ) с использованием метода стандартных добавок для подтверждения идентификации пиков.
- Практическое ограничение: чувствительность метода к матричным эффектам образца требует разбавления или стандартизации для точного количественного определения в сложных биожидкостях.
