Отделение биологически активных малых молекул, пептиды из природных источников и белки от микробов по методу preparative Isoelectric Focusing (IEF)

Наш протокол описывает новые выводы о разделении и очищении активных молекул от растительного экстракта. Ученые могут использовать эти методы, чтобы изолировать небольшие молекулы и пептиды от природных источников продукта для терапевтических пользователей. Ознакомьтесь с компонентами инструмента и его методами сборки.

Важно быть уверенным в том, что выборка, которая будет разделена, подготовлена предлагаемыми руководящими принципами. Этот метод включает в себя несколько процессов сборки инструмента. А визуальная демонстрация поможет пользователям следить и успешно применять их к исследованиям.

После сборки жидкой фазы блок IEF, описанный в инструкции, уравночные мембраны обмена аниона с 0,1 молярным гидроксидом натрия и мембранами обмена катиона с 0,1 молярной фосфорной кислотой. Выровнять резиновые прокладки так, чтобы три больших продолговатых отверстия оставались разблокированными резиной. Это поможет обменять ионы между электродом и образцовых отсеков через мембрану во время электрофорез.

Соберите внутреннюю и внешнюю часть электрода путем выравнивания трех продолговатых отверстий в ионных прокладках обмена. Затем заполните электроды соответствующими электролитами, чтобы предотвратить высыхание их мембран. Далее, затяните пластиковый держатель винта, чтобы обеспечить без утечки сборки.

Обложка образца доски сбора с запечатыванием ленты. Затем соберите части фокусировки камеры над керамическим охлаждающим пальцем в следующей последовательности: электрод анода, ядро нейлоновой мембраны, фокусировка камеры и катод электрода. Используя 50 миллилитровый шприц, заполните фокусировку предварительно охлажденой дистиллированной водой.

Для стандартной ячейки IEF добавьте 60 миллилитров воды. Подключите блок IEF к циркулирующей охлаждающей воде при четырех градусах Цельсия. Работа устройства на 15 Вт и 3000 вольт, пока напряжение стабилизируется, примерно три-пять минут.

Затем выключите источник питания. Используя коллектор фракций, удалите воду из клетки. Повторное запечатывание досок коллекции запечатыванием ленты.

Добавьте 0,6 грамма растительного экстракта Gymnema sylvestre к 60 миллилитров дистиллированной воды. Растворите растительный экстракт, смешивая в роликовой трубке в течение пяти минут. Чтобы удалить нерастворимые частицы, центрифуга этого раствора в 10 000 раз G в течение пяти минут.

Перенесите супернатант на стеклянный стакан объемом 150 миллилитров и добавьте амфолит, чтобы создать 1%-ный раствор по объему, приблизительно 0,6 миллилитров. Используя 50-миллилитровый шприц с 1,5-дюймовой 19-дюймовой тупой иглой конца, загрузите это решение в ячейку IEF через доски для сбора образцов. Затем снимите ячейку с стенда и коснитесь электродной камеры, чтобы выбить и удалить пузырьки.

Подключите устройство к охлаждающей воде. С подачи питания до постоянных 15 Вт начинают фракциоцию. Запустите блок IEF до тех пор, пока напряжение не достигнет постоянного значения, примерно три часа.

После нажатия урожая на кнопку выровнять фракции коллектор булавки с коллекционными досками. Нажмите булавки через уплотнение ленты, чтобы начать сбор Gymnema sylvestre фракций. Вырастите одну колонию C.albicans и дрожжевой бульон pepitone dextrose на ночь при 30 градусах Цельсия со тряской.

Перенесите культуру в центрифугу и соберите дрожжевые клетки путем центрифугации в 10 000 раз G в течение пяти минут. После удаления супернатанта, приостановить дрожжевых клеток в буфере и повернуть подвеску в роликовой трубке в течение одного часа при пяти градусах по Цельсию. Чтобы удалить дрожжевые клетки, центрифуга суспензии на 10000 раз G в течение пяти минут.

Затем фильтруй экстракт белка через фильтр 0,45 микрометра. Передача экстракта белка на диализ трубки и диализ против воды в течение 15 часов при четырех градусах по Цельсию. Оценив концентрацию белка, соберите объем белкового экстракта, содержащего 500 миллиграммов общего белка.

Разбавить 500 миллиграммов белка в 60 миллилитров воды, содержащей 1%ampholyte по объему. Используя шприц, загрузите разбавленный экстракт белка в клетку IEF и оперировать устройством при постоянной 15 Вт в течение четырех часов. Так как этот инструмент использует высоковольтное электроснабжение, пользователь должен принять все меры предосторожности, чтобы избежать прямого контакта с живыми электродами.

Сборщик фракций содержит 20 пластиковых трубок, каждая по 12 миллиметров на 75 миллиметров. И он подключен к вакуумной насосу. Приготовьтесь собирать фракции, нажав на урожай на кнопку.

Затем выровнять 20 булавки коллекции на коллекторе фракций с 20 доска сбора так запечатанных фокусировки ячейки. Нажмите на булавки коллекции через уплотнительную ленту и одновременно включите вакуумный насос. Каждая трубка будет собирать белковую фракцию около трех миллилитров.

После уменьшения и кипячения белковых фракций, проанализируйте их на 12,5%SDS страницу геля. Пятно гель с Coomassie Голубой краситель и поместите его на рокер при комнатной температуре. Через два-три часа обезвить гель.

Затем завехайте изображение геля с помощью гель-изображения. Подготовьте суспензию дрожжевых клеток, разбавляя ночную культуру C.albicans в соотношении 1:1000 в среде культуры клеток RPMI, дополненной 50 миллимоляной глюкозой. Добавьте 90 микролитров клеточной подвески к каждому колодец из 96 хорошо пластины.

Затем добавьте 10 микролитров каждой фракции G.sylvestre в отдельные скважины. В качестве отрицательного контроля добавьте 10 микролитров воды с 1%амфолитом в отдельные скважины. После инкубации пластины 96 хорошо при 37 градусах по Цельсию в течение 12 часов, наблюдать пластины под микроскопом.

Отсутствие нитей роста указывает на ингибирование C.albicans дрожжей до гифы преобразования. Двадцать фракций экстракта G.sylvestre были получены жидкой фазой МЭФ. Молекулы темного цвета, гимнастические кислоты, мигрировали и были обогащены в анодном конце блока.

На катодной конце наблюдались полупрозрачные светло-желтые фракции. Aliquots от каждого преломления G.sylvestre были уменьшены, вареные и разрешены страницей SDS. Пятно Coomassie Blue показало различные полипептидные полосы около пяти килодальтонов, обогащенных фракциями от 16 до 19.

Гимнемические кислоты в первой фракции, и в ближайшие несколько фракций не были обнаружены, поскольку они не proteinaceous. Тем не менее, эти молекулы могут быть разделены TLC и обнаружены под ультрафиолетовым светом. Фракция 10 не содержала обнаруживаемого количества этих малых молекул, что свидетельствует о том, что большинство органических малых молекул были обогащены фракциями от одного до трех.

Все 20 фракций G.sylvestre были анализированы для ингибирования преобразования дрожжей в гифу и роста гипхала в C.albicans. Наибольшее ингибирование наблюдалось во фракции 1 и практически не наблюдалось ингибирование в фракциях 10 и выше. Белки поверхности клеток из C.albicans были дробированы с помощью жидкой фазы IEF.

А алициты из 18 фракций были проанализированы на странице SDS. Обогащенные белки были видны в нескольких фракциях. Во-первых, малые молекулы не могут быть разделены изоэлектрической фокусировки, потому что они, как полагают, не амбулаторно.

Наши исследования показывают, что они амбулаторные, по крайней мере еженедельно, и этот метод может быть изучен далее для других малых молекул.