Выделение и характеристика экзосом фибробластов скелетных мышц

Преимущество использования дифференциального центрифугирования для этого протокола заключается в том, что оно легко масштабируется до литров и, следовательно, идеально подходит для выделения экзосом из первичных фибробластов. Очищенные экзосомы могут быть получены из различных типов клеток и тканей, выделенных из различных моделей заболеваний. Экзосомы могут быть использованы в качестве диагностических биомаркеров.

Демонстрировать эту процедуру будет Дианта ван де Влеккерт, ученый из лаборатории д'Аццо Для начала взвесьте мышцы мыши, а затем перенесите их в 10-сантиметровую чашку. Работая под капюшоном, измельчите мышцы скальпелями, чтобы получить тонкую пасту. Переложите мелко нарезанную мышечную пасту в 50-миллилитровую тубусу и добавьте раствор для варежения, используя в 3,5 раза больше объема на миллиграмм ткани.

Выдерживать в течение 45 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы помочь полной диссоциации, тщательно перемешивайте суспензию 5-миллилитровой пипеткой каждые 10 минут. Чтобы инактивировать раствор для варения, добавьте в клеточную суспензию 20 миллилитров DMEM Complete.

Проведите пипетку через 70-микрометровый нейлоновый клеточный фильтр, помещенный в 50-миллилитровую пробирку, а затем промойте клеточный фильтр еще 5 миллилитрами DMEM Complete. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300г в течение 10 минут при комнатной температуре. Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах DMEM Complete.

Посадите клетки в 10-сантиметровую чашку, затем поместите чашку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа и 3% кислорода. Культура фибробластов скелетных мышц должна поддерживаться на низком уровне кислорода для обеспечения физиологических условий освещения. Уровень кислорода в скелетных мышцах составляет примерно 2,5%После того как клетки достигнут 100% слияния, культивируйте их в течение дополнительного дня, затем промойте их PBS и добавьте один миллилитр раствора трипсинизации.

После инкубации клеток в течение 10 минут остановите трипсинизацию, добавив 10 миллилитров DMEM Complete. Переложите клеточную суспензию в 50-миллилитровую пробирку, а затем центрифугируйте клетки при 300г в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем повторно суспендируйте гранулу в 20 миллилитрах полного комплекта и засейте клетки в 15-сантиметровую посуду.

Соберите кондиционированную среду из культивируемых фибробластов в 15-миллилитровую пробирку. Центрифугируйте кондиционированную среду при 300 г в течение 10 минут для гранулирования живых клеток. Переложите надосадочную жидкость в новую 50-миллилитровую пробирку и гранулируйте мертвые клетки, центрифугируя пробирку при температуре 2 000 г в течение 10 минут.

Затем перенесите надосадочную жидкость в полипропиленовую пробирку объемом 38,5 миллилитров и центрифугируйте пробирку при плотности 10 000 г в течение 30 минут, чтобы удалить органеллы, апоптотические тела и фрагменты мембраны. Чтобы гранулировать экзосомы, переложите надосадочную жидкость в ультрапрозрачную пробирку объемом 38,5 миллилитров и ультрацентрифугируйте ее при 100 000 г в течение 1,5 часов. Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость, оставив примерно один миллилитр кондиционированной среды.

Промойте экзосомную гранулу и повторно суспендируйте ее в 30 миллилитрах ледяного PBS. Снова центрифугируйте экзосомы при 100 000 г в течение 1,5 часов. Чтобы завершить очистку, удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования, стараясь не потревожить экзосомальную гранулу.

Ступень экзосомной гранулы может быть рыхлой и легко отделяться. Поэтому удаление надосадочной жидкости PBS следует проводить очень осторожно с помощью пипетки объемом 200 микролитров. Повторно суспендируйте гранулу в ледяной PBS, используя 25 микролитров на 15-сантиметровую чашку фибробластов.

Наконец, измерьте концентрацию белка с помощью набора для анализа белка BCA и считывателя микропланшетов на 562 нанометрах. Этот протокол представляет собой высоковоспроизводимый и последовательный метод очистки экзосом. Просвечивающая электронная микроскопия показывает относительно одинаковые размеры этих экзосом.

Иммуноблоттинг лизатов экзосом показывает канонический паттерн экспрессии белка и отсутствие белковых загрязнителей ЛДГ и кальнексина. Экзосомы были разделены градиентом плотности сахарозы, а отдельные фракции были исследованы на вестерн-блоттинге с антителами против Alix, CD9 и CD81. Экзосомы последовательно оседают в фракциях с третьей по шестую.

Выделенные и концентрированные биоактивные экзосомы могут быть использованы для анализа методом электронной микроскопии и масс-спектрометрии, а также для экспериментов по поглощению in vitro и in-vivo для функциональных исследований. Этот протокол подходит для выделения экзосом из клеток с низкой секреторностью и может быть применен для изучения участия экзосом в фиброзных заболеваниях человека.