Синтез Aptamer-PEI-g-PEG Модифицированные золотые наночастицы загружены доксорубицином для целевой доставки лекарств

Из-за резистентности к препаратам и токсичности применение доксорубицина в клинике ограничено. Этот протокол обеспечивает разлагаемый носитель для удержания высвобождения этого терапевтического агента. Преимущество этого метода заключается в том, что синтезированный носитель может быть использован для доставки препарата непосредственно к раковым клеткам, вызывая гибель только в раковых клетках.

Для синтеза CT-PEG сначала добавьте 1,46 грамма янтарного ангидрида и 209 миллиграммов 4-диметиламинопиридина в 100-литровую колбу с круглым дном. Далее добавьте в колбу 15 миллилитров безводного тетрагидрофурана и вставьте в колбу стеклянную пробку, перед тем как инкубировать реакцию в течение 30 минут при нуле градусов Цельсия. Во время инкубации добавьте в новую колбу 4,208 грамма ПЭГ, 1,8 миллилитра триэтиламина и 15 миллилитров безводного тетрагидрофурана и закройте колбу стеклянной пробкой.

В конце инкубации с помощью шприца под воздействием азота медленно переложите второй раствор в первую колбу. Перемешайте новый раствор в течение двух часов при нуле градусов Цельсия, прежде чем продолжить реакцию при комнатной температуре в течение ночи. На следующее утро используйте ротационный испаритель при температуре 40 градусов Цельсия и 0,1 мегапаскаля, чтобы концентрировать реакционный раствор и удалить растворитель тетрагидрофурана.

Через час растворите реакционный раствор в 15 миллилитрах 1,325 грамма на миллилитр дихлорметана при комнатной температуре, прежде чем добавить 15 миллилитров холодного диэтилового эфира для получения продукта осаждения дикислот ПЭГ. Затем удалите растворитель с помощью фильтровальной бумаги и высушите осадок в вакууме в течение 48 часов при комнатной температуре. Для синтеза сополимера PEI-g-PEG добавьте 305,47 мг осадка CT-PEG и пять миллилитров ДМСО в новую колбу и перемешайте реакцию при комнатной температуре до полного растворения CT-PEG.

Далее растворите 49,46 миллиграмма EDC в пяти миллилитрах ДМСО и добавьте раствор в колбу. Перемешивайте реакцию в течение 30 минут при комнатной температуре, перед тем как растворить 29,69 миллиграмма N-гидроксисукцинимида и пять миллилитров ДМСО и добавить полученный раствор в колбу. Продолжайте помешивать реакцию в течение трех часов при комнатной температуре.

Ближе к концу инкубации растворите 28,6 микролитров PEI в 10 миллилитрах ДМСО и добавьте раствор по каплям в колбу. Помешивайте реакцию при комнатной температуре не менее трех суток. В конце инкубации переложите прореагировавший раствор в диализный мешок с отсечкой 1000 молекулярной массы и поместите мешок в стакан объемом один литр, содержащий 500 миллилитров ультрачистой воды в качестве диализата.

В конце диализа переложите раствор в диализный мешок с отсечкой 10 000 молекулярной массы и поместите мешок в стакан объемом один литр с 500 миллилитрами ультрачистой воды в качестве диализата. В конце второго диализа используйте ротационный испаритель при температуре 40 градусов Цельсия и 0,1 мегапаскаля, чтобы концентрировать раствор и сублимационно высушить образец для получения порошка PEI-g-PEG. Для покрытия наночастиц золота продуктом PEI-g-PEG растворите пять миллиграммов приготовленного PEI-g-PEG в пяти миллилитрах ультрачистой воды в новой колбе и установите колбу со стеклянной пробкой.

Добавьте в колбу 100 миллилитров 0,3 миллимолярного раствора хлорида ауры и размешайте раствор в течение трех часов при комнатной температуре. Цвета должны сразу меняться от светло-желтого до темно-желтого. По окончании инкубации добавьте в колбу один миллилитр одного миллиграмм на миллилитр раствора боргидрида натрия.

Цвет должен сразу измениться с темно-желтого на золотисто-желтый, и размешайте раствор еще три часа при комнатной температуре. Затем диализуйте продукт реакции с помощью диализного мешка с отсечкой по молекулярной массе 1000 в течение трех дней, как показано на рисунке, чтобы получить раствор наночастиц золота с покрытием PEI-g-PEG. Для прививки доксорубицина к наночастицам золота с покрытием PEI-g-PEG.

Добавьте в новую колбу один миллилитр 2,2 мг на миллилитр раствора доксорубицина и 20 миллилитров раствора наночастиц золота с покрытием PEI-g-PEG и накройте колбу стеклянной пробкой. Далее растворите 0,727 миллиграмма EDC в одном миллилитре ультрачистой воды и добавьте раствор EDC в колбу. Растворите 0,437 мг N-гидроксисукцинимида в одном миллилитре ультрачистой воды и добавьте раствор N-гидроксисукцинимида в колбу для одночасовой инкубации при перемешивании при комнатной температуре.

В конце инкубации продукт реакции подвергается диализу в диализном мешке с отсечкой по молекулярной массе 1000 в течение трех дней, как показано на рисунке, для получения раствора наночастиц золота, покрытого покрытием доксорубицин g-PEI-g-PEG. Для прививки аптамера AS1411 к DOX-g-PEI-g-PEG. Добавьте 20 миллилитров раствора наночастиц золота с покрытием доксорубицина DOX-g-PEI-g-PEG до концентрации AS1411 примерно в четыре раза при оптической плотности.

Растворите 28,76 миллиграмма EDC в одном миллилитре ультрачистой воды и добавьте раствор EDC в колбу. Растворите 17,27 мг N-гидроксисукцинимида в одном миллилитре ультрачистой воды и добавьте раствор N-гидроксисукцинимида в колбу для одночасовой инкубации при перемешивании при комнатной температуре. Затем диализуйте продукт реакции в диализном мешке с отсечкой по молекулярной массе 1000 в течение трех дней, как показано на примере получения наночастиц золота с покрытием AS1411-g-Doxorubicin-g-PEI-g-PEG.

Протонная ЯМР-спектроскопия может быть использована для подтверждения успешного синтеза полимера CT-PEG и сополимеров PIE-g-PEG. Ультрафиолетовая спектроскопия может быть проведена для определения успешной функционализации и постепенной загрузки полученного сополимера на наночастицы золота. Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия может быть использована для исследования химической связи сополимера на наночастицах золота.

Динамическое рассеяние света может быть выполнено для определения распределения по размерам полученных наночастиц. В этом анализе с помощью просвечивающей электронной микроскопии были выявлены некластеризованные наночастицы с однородной морфологией. Анализ жизнеспособности клеток выявил снижение количества клеток A549 с течением времени и в ответ на увеличение концентрации наночастиц.

По сравнению с группой свободного доксорубицина, количество клеток увеличилось, однако, что указывает на снижение токсичности. Кроме того, анализ профиля высвобождения доксорубицина показывает, что устойчивое высвобождение доксорубицина из функционализированных наночастиц вызывало уменьшение клеток А549. Получение сополимера PEI-g-PEG и этапы прививки AS1411 важны для успеха проведения процедуры.

Тот же носитель препарата может быть достигнут путем прививки AS1411 перед прививкой препаратов, но эффективность загрузки препарата будет снижена.