Инфекция личинок зебры с спорами Аспергилла для анализа взаимодействия хост-патогенов

Этот протокол демонстрирует модель инфекции личинок рыбок данио Aspergillus, которую мы можем использовать для исследования врожденных иммунных реакций на этот грибок. Основное преимущество модели личинок данио-рерио заключается в том, что мы можем визуализировать взаимодействие патогенов иммунных клеток и прогрессирование инфекции внутри живого животного-хозяина на протяжении многодневной инфекции. Результаты этой модели могут быть применимы для открытия новых терапевтических мишеней для лечения инвазивного аспергиллеза у пациентов с ослабленным иммунитетом.

Микроинъекция спор личинкам данио-рерио является сложным методом, который требует значительной практики, прежде чем можно будет достичь последовательных и воспроизводимых результатов. Для выполнения микроинъекций используйте установку, которая поставляется в комплекте с инжектором давления, блоком вакуумного давления, ножным переключателем, держателем микропипетки, микроманипулятором, а также магнитной стойкой и пластиной. Все они подключены к источнику сжатого воздуха.

Откройте клапан сжатого воздуха. И включаем микроинжектор. Установите давление примерно на 25 фунтов на квадратный дюйм, усилие на 60 миллисекунд и вакуумное давление на 1 фунт на квадратный дюйм.

Используйте наконечник для пипетки с микрозагрузкой, чтобы загрузить иглу для микроинъекций тремя-пятью микролитрами PBS или споровой суспензией с феноловым красным. Затем установите иглу на микроманипулятор. Aspergillus fumigatus является условно-патогенным микроорганизмом человека.

Существует риск прокола кожи заряженной иглой. Игла должна быть очень плотно прикреплена к микроинъектору, при этом исследователи должны всегда надевать перчатки и внимательно следить за движениями своих рук вокруг иглы, чтобы избежать прокола. Расположите микроманипулятор так, чтобы конец иглы был виден под стереомикроскопом при наименьшем увеличении.

Увеличьте масштаб до 4-кратного увеличения, держа иглу в поле зрения. Затем с помощью острых щипцов прикрепите конец иглы. Нажмите на педаль впрыска, чтобы визуализировать размер капли.

И продолжайте обрезать иглу, пока не выйдет около трех нанолитров споровой суспензии. Когда все будет готово, отодвиньте микроманипулятор и иглу в сторону, чтобы случайно не задеть иглу во время расположения личинок на инъекционной пластине. Вылейте трикаин Е3 с инъекционной пластины.

И перенесите в тарелку около 24 обезболенных двухдневных личинок с минимальным количеством Е3. Затем расположите личинок в соответствии с направлением, в котором они смотрят, расположив всех личинок вправо в одном ряду, а всех смотрящих влево в ряд ниже. Установив микроскоп на наименьшее увеличение, верните микроманипулятор назад так, чтобы игла находилась близко к личинкам под углом 30-60 градусов.

Увеличьте масштаб до максимального увеличения. И используйте ручки точной регулировки для дальнейшей регулировки положения иглы. Введите споровую суспензию в жидкость рядом с личинками, чтобы убедиться, что из иглы выходит 30-70 спор.

Затем переместите пластину так, чтобы игла оказалась прямо над ней и располагалась рядом с первыми личинками. Начиная с личинок, которые обращены в сторону иглы. Введите иглу через ткань вокруг глазного пузырька и проколите ее насквозь в задний желудочек мозга, перемещая пластину по мере необходимости, чтобы получить правильную ориентацию личинки.

Визуально убедитесь, что конец иглы находится в центре заднего желудочка мозга. Затем нажмите на ножную педаль, чтобы ввести споры, и аккуратно втяните иглу. После введения всех личинок в оба ряда снова отодвиньте иглу в сторону.

И зум до меньшего увеличения. Феноловый красный краситель все еще должен быть виден в заднем мозге каждой личинки. Утилизируйте всех личинок с неудачными инъекциями, а оставшихся личинок перенесите в чашку Петри, смыв их с тарелки свежим Е3. Дважды промойте личинку Е3, и убедитесь, что они оправились от наркоза.

Сразу после инъекции перенесите восемь личинок в отдельные 1,7 миллилитровые пробирки и усыпьте их. Приготовьте 1 мл PBS с ампициллином и канамицином. Удалите как можно больше жидкости из пробирок с личинками.

Затем добавьте 90 микролитров PBS с антибиотиками. Гомогенизируйте личинки в TissueLyser со скоростью 1800 колебаний в минуту в течение шести минут. Затем уменьшите их до 17 000 умноженных на G в течение 30 секунд.

Дозируйте гомогенизированную суспензию из каждой пробирки в середину маркированной пластины GMM и распределите ее с помощью одноразового L-образного разбрасывателя. Следите за тем, чтобы не растекаться по ободу. Выдерживайте пластины вверх дном при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-трех дней.

Затем подсчитайте количество образовавшихся колоний. Разделите оставшиеся введенные личинки на две 3,5 миллиметровые тарелки. Один для медикаментозного лечения, а другой для контроля.

Удалите как можно больше жидкости и добавьте E3 с помощью пульта управления автомобилем в одну тарелку. И Е3 с обработкой, представляющей интерес для другого. С помощью пипетки перенесите каждую личинку в лунку в 96-луночной пластине.

И следить за их выживаемостью в течение семи дней. В день визуализации приготовьте одну чашку Петри диаметром 3,5 миллиметра со 100 микромолярными ПТУ и одну чашку с трикаином Е3. Добавьте трикаин E3 в камеры устройства Z-wedge E и используйте микропипетку P100 для удаления пузырьков воздуха из камер и удерживающего канала.

Затем удалите весь избыток трикаина Е3 за пределы камер. Пипеткой поднимите одну личинку и перенесите ее в чашку с помощью ПТУ Е3. Затем переложите его в трикаин E3, добавив как можно меньше жидкости.

Через 30 секунд перенесите личинок под наркозом в загрузочную камеру устройства для ранения и захвата. Извлеките трикаин Е3 из раневой камеры, и выпустите его в загрузочную камеру для того, чтобы переместить хвост личинок в рестрикционный канал. Убедитесь, что личинка расположена на боковой, дорсальной или дорсолатеральной стороне, чтобы задний мозг можно было визуализировать с помощью перевернутой линзы объектива.

После визуализации личинки с помощью конфокального микроскопа выпустите трикаин Е3 в ранящую камеру, чтобы вытолкнуть личинку из сдерживающего канала в загрузочную камеру. Возьмите личинку и перенесите ее обратно в блюдо с трикаином Е3. Затем переложите его в тарелку с E3 PTU с как можно меньшим количеством жидкости.

Промойте его в PTU и переложите обратно в 48-луночную пластину. Споры Aspergillus микроинъецировали в задний мозг личинок данио-рерио, отслеживали исход инфекции. У личинок дикого типа наблюдалась очень небольшая смертность, от 80 до 100% личинок выжили за весь эксперимент.

Достоверное снижение выживаемости наблюдалось у иммуносупрессированных личинок. При количественном определении колониеобразующих единиц из инфицированных личинок дикого типа наблюдалась стойкость спор и медленный клиренс с течением времени. Количество спор, выживших через один, два, три, пять и семь дней после заражения, было нормализовано до количества введенных спор, чтобы сравнить персистенцию и клиренс между репликами.

Когда макрофаги были помечены, скопление микрофагов примерно у 50% личинок обычно наблюдалось, начиная с двух-трех дней после заражения. Рекрутирование нейтрофилов задерживалось, происходя в основном после прорастания гриба. При этом грибковая нагрузка сохранялась в течение всего эксперимента у большинства личинок.

Клиренс наблюдался у некоторых через пять дней после заражения. В другой подгруппе личинок наблюдалось распространение грибов в области за пределами заднего мозга. Область вокруг глазного пузыря является одним из мест, где было обнаружено это распространение.

Прорастание грибка обычно наблюдалось через пять дней у 60% личинок. Площадь кластера фагоцитов, рекрутирование макрофагов и рекрутирование нейтрофилов варьировались с течением времени у всех личинок. Некоторые из них имеют тенденцию к росту на протяжении всего эксперимента, а другие со временем исчезают.

Эту процедуру можно сочетать с генетическими манипуляциями на рыбках данио, такими как CRISPR, чтобы определить потребность в специфических путях хозяина для успешного врожденного иммунного ответа на аспергиллы. Этот протокол позволил визуализировать взаимодействия клеток врожденного иммунитета aspergillus в режиме реального времени в живых, неповрежденных хозяевах.