Воздушно-жидкий интерфейс Бронхиальный эпителиальный модель для реалистичных, повторных ингаляционных воздействия воздушно-капельным путем частиц для тестирования токсичности
13 мая 2020 г.
Описана клеточная культура и метод воздействия бронхов in vitro для реалистичного, повторного ингаляционного воздействия частиц для тестирования токсичности.
Этот протокол описывает, как культивировать и подвергать воздействию эпителиальные клетки бронхов человека через воздух. Это более реалистичная модель для изучения воздействия на легкие вдыхаемых частиц. Клетки легких, подготовленные с помощью этих методов, напоминают реальную среду в легких. Клетки будут вырабатывать слизь, образовывать плотный барьер, оставаясь жизнеспособными в течение нескольких недель. Этот метод может быть использован для изучения токсического воздействия взвешенных в воздухе частиц. Он также может быть использован для изучения инфекционных заболеваний дыхательных путей и лекарств, принимаемых ингаляционным путем. Когда вы впервые пробуете этот протокол, имейте в виду, что для создания agile-алгоритма требуются знания специалиста. Для этого также требуется специальное оборудование для измерения. Начните с разбавления клеток в предварительно подогретой среде для клеточных культур или КМК до концентрации 500 000 клеток на миллилитр для 6-луночных вставок. И 250 000 ячеек на миллилитр для 12-луночных вкладышей. Поместите планшет для клеточной культуры со вставками в асептические условия, а базальную боковую сторону заполните предварительно подогретым CCM. После смешивания клеточной суспензии поместите ее пипеткой поверх мембраны во вкладыше для клеточной культуры. Накройте тарелку крышкой и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Культивируйте клетки в погруженных условиях в течение семи дней, чтобы позволить им достичь слияния, меняя КМК каждые два-три дня. Для измерения трансэпителиального электрического сопротивления используют заряженный эпителиальный вольтомметр, дополненный набором электродов из палочек для еды. Очистите электроды 70% этанолом. Поместите более длинный электрод во внешнюю питательную среду до тех пор, пока он не коснется дна чашки. Причем более короткий электрод в среде, не касаясь мембраны. Начните сбор измерений на пустой вкладыше без ячеек. Подождите, пока измерение стабилизируется и запишите сопротивление в Омах. Это измерение представляет собой сопротивление мембраны вкладыша без каких-либо ячеек или сопротивления заготовки. Повторите измерение для каждой пластины и вычтите сопротивление заготовки, чтобы получить истинное сопротивление, и умножьте на площадь поверхности пластины. Снимите среду с апикальной стороны вкладышей и добавьте предварительно прогретый МНЛЗ на базолатеральную сторону лунки. Среда должна касаться мембраны снизу, но не вытекать на верхнюю часть вставки. Культивируйте клетки на границе раздела воздух-жидкость в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение семи дней. Смена базолатеральной среды каждые два-три дня. Незадолго до воздействия на частицы приготовьте суспензию 1%-ных наночастиц. Предварительно смочите НЧ 96% этанолом. Добавьте чистую воду до конечной концентрации 1%NPs. Положите флакон в стакан на лед. Обрабатывайте суспензию ультразвуком в течение 16 минут, добавьте в флакон с дисперсией мешанину, затем подключите флакон к перистальтическому насосу через небольшую трубку и отрегулируйте расход до 25 миллилитров в час. За сутки до облучения включите автоматическую станцию облучения или AES и дайте шкафу нагреться до температуры 37
Обзор
Данное исследование сосредоточено на разработке модели бронхов in vitro для имитации повторного ингаляционного воздействия взвешенных в воздухе частиц с целью тестирования на токсичность. Культивируемые эпителиальные клетки бронхов человека демонстрируют длительную жизнеспособность и реалистичную выработку слизи, что делает данную модель подходящей для токсикологических исследований и изучения инфекционных заболеваний.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Токсикология
- Биология дыхания
- Модели in vitro
Теоретические основы
- Необходимость в реалистичных моделях воздействия на легкие
- Важность изучения вдыхаемых частиц
- Применение в исследованиях систем доставки лекарств и инфекционных заболеваний
Используемые методы
- Методы культивирования эпителиальных клеток бронхов человека
- Условия культивирования на границе раздела фаз «воздух-жидкость»
- Измерение трансэпителиального электрического сопротивления
Основные результаты
- Клетки образуют плотный барьер и вырабатывают слизь
- Жизнеспособность сохраняется в течение нескольких недель в контролируемых условиях
- Метод валидирован для использования в токсикологических исследованиях
Выводы
- Разработанная модель эффективно имитирует воздействие вдыхаемых частиц на легкие
- Важные перспективы для тестирования токсичности и исследований дыхательной системы
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Реалистичные модели бронхиального эпителия in vitro имеют решающее значение для прогностического тестирования токсичности при ингаляционном воздействии и исследований по доставке респираторных лекарственных средств. Система «воздух-жидкость» (ALI) с использованием клеток Calu-3 позволяет проводить исследования с многократным воздействием низких доз, которые максимально точно имитируют условия дыхательных путей человека, что обеспечивает более высокую прогностическую значимость при оценке соединений на ранних стадиях. Данный подход удовлетворяет потребность в физиологически релевантных и воспроизводимых моделях в рамках разработки респираторных биофармацевтических препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет механистически снизить риски при изучении воздействия ингаляционных соединений на эпителий дыхательных путей.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней за счет сохранения плотных соединений и продукции слизи в течение длительного времени.
- Повышает прогностическую достоверность при оценке респираторной токсичности и безопасности.
Скрининг и разработка анализа
- Представляет собой валидированную, воспроизводимую систему для количественного измерения целостности эпителиального барьера.
- Обеспечивает стандартизацию анализа при многократном воздействии частиц в низких концентрациях.
- Позволяет проводить надежную оценку воздействия переносимых по воздуху соединений в условиях непрерывного потока.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует релевантным моделям дыхательных путей для трансляционных исследований биомаркеров заболеваний.
- Обеспечивает непрерывный переход от этапа поиска in vitro к протоколам доклинической токсикологии при ингаляционном воздействии.
- Снижает риск неудач на поздних стадиях разработки за счет моделирования реалистичных сценариев воздействия.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данная бронхиальная модель с интерфейсом «воздух-жидкость» (ALI) интегрирована в континуум от этапа поиска до доклинических исследований терапевтических средств для лечения респираторных заболеваний и ингаляционной токсикологии.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о функции барьера дыхательных путей и токсичности частиц.
- Скрининг: Предоставляет воспроизводимые количественные данные о трансэпителиальном сопротивлении и жизнеспособности клеток.
- Аналитика: Позволяет осуществлять непрерывный мониторинг концентрации при воздействии и введенной дозы.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты исследований in vitro с доклиническими исследованиями ингаляционного воздействия с конечными точками, релевантными для заболевания.
- Корпоративное повторное использование: Предоставляет стандартизированную платформу, адаптируемую для различных исследований лекарственных средств и твердых частиц, передаваемых по воздуху.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает неопределенность механизмов при тестировании респираторной токсичности.
- Операционная ценность: улучшает воспроизводимость и масштабируемость протоколов повторного воздействия.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и повышает эффективность использования капитала при создании портфеля респираторных препаратов.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритезацию ингаляционных соединений и лекарственных форм с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток на границе раздела фаз «воздух-жидкость» (ALI) и измерением проницаемости эпителиального барьера.
- Необходимо специализированное оборудование для обеспечения непрерывного потока при воздействии и мониторинга электрического сопротивления.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов воздействия и анализа данных.
- Метод adaptable к различным типам и концентрациям взвешенных частиц в пределах ограничений модели.
- Результаты зависят от поддержания жизнеспособности клеток и целостности плотных контактов в течение длительных периодов культивирования.
