Одновременно изоляция и культура миоцитов предсердий, желудочковых миоцитов и немиоцитов из сердца взрослой мыши

Здравствуйте, меня зовут Крис Глемботски. Я профессор медицины в Медицинском колледже Университета Аризоны в Фениксе. И я директор Трансляционного сердечно-сосудистого центра, также расположенного здесь, в Фениксе.

Сегодня я хотел бы представить вам двух людей, которые продемонстрируют нашу новую технику: доктора Эрика Блэквуда, моего старшего постдокторанта и преподавателя, проходящего обучение, и старшего научного сотрудника мисс Алину Билал. Современные протоколы выделения сердечных миоцитов ограничивают количество и жизнеспособность клеток в культуре, создавая экспериментальный тупик для дальнейшего понимания физиологии сердца и патофизиологии. Этот протокол направлен не только на ускорение процесса выделения сердечных клеток взрослых мышей, но и на увеличение выхода клеток и жизнеспособности сердечных клеток предсердий и желудочков одновременно из одного сердца мыши.

Этот метод имеет глубокие последствия для терапевтических открытий, а также для того, чтобы такие заболевания, как фибрилляция предсердий, могли быть лучше охарактеризованы на клеточном уровне, что позволило идентифицировать терапевтические мишени. Мы рекомендуем лицам, не имеющим предыдущего опыта микрохирургии, тщательно практиковать этапы экплантации восходящей аорты и канюляции, прежде чем пытаться пройти протокол полной изоляции. Начните с использования ножниц, чтобы сделать разрез кожи по средней линии, чтобы быстро открыть грудную клетку 10-недельной мыши C57 black 6J, находящейся под наркозом, от середины живота до челюсти.

Войдите в брюшину и очистите диафрагму путем тупого рассечения. Отрежьте грудную клетку с разрезами вдоль грудной стенки на боковой поверхности с обеих сторон и отрежьте фиброзные соединения между сердцем и грудной стенкой. После полного удаления грудной клетки с помощью небольших щипцов и ножниц аккуратно приподнять сердце за верхушку, обнажив заднюю часть сердца.

Для эксплантации сердца необходимо рассечь непосредственно ниже безымянной артерии на восходящей аорте и немедленно поместить сердце в ледяную среду для перфузии сердца. Быстро рассеките оставшуюся ткань, чтобы обнажить восходящую аорту, и с помощью микрорассекающих щипцов и ножниц очистите область вокруг аорты от лишней ткани. С помощью щипцов с тонкими наконечниками поместите очищенную аорту на два миллиметра на перфузионную канюлю и закрепите канюлю шелковым швом 5-0.

Промойте канюлированное сердце сердечной перфузионной средой со скоростью потока 3 миллилитра в минуту в течение четырех минут, прежде чем переключиться на буфер для пищеварения на 15-17,5 минут. В течение последних минут перфузии соберите восемь миллилитров буферного потока для пищеварения и перенесите сердце из канюли в пластиковую 60-миллиметровую чашку для культивирования, затем удалите лишнюю ткань и погрузите сердце в 2,5 миллилитры буфера для пищеварения. Для выделения клеток предсердий рассеките предсердия вдали от сердца и поместите предсердия в пластиковую 30-миллиметровую чашку для культур, содержащую 750 микролитров буфера для пищеварения.

С помощью хирургических ножниц с тонкими наконечниками измельчите и раздразните предсердия, прежде чем дополнительно рассекать ткань тонкими щипцами, не взбалтывая и не раздвигая мышечные волокна. С помощью стерильного наконечника для переноса пипетки продолжайте аккуратно перемешивать и диссоциировать ткань в течение 15 минут. Каждые пять минут наблюдайте за диссоциацией миоцитов предсердий под объективом 10X микроскопа Brightfield.

По мере того, как ткань будет перевариваться, продолжайте осторожно перемешивать и диссоциировать ткань с помощью стерильного наконечника для переносной пипетки с меньшим размером пор перед тем, как перенести клеточную суспензию в стерильную двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Промойте 30-миллиметровую пластину 750 микролитрами 37 градусов Цельсия в буфере для остановки миоцитов и соедините буфер с клеточной суспензией. Дайте миоцитам предсердий осадиться под действием силы тяжести и осторожного перемешивания в течение 10 минут при комнатной температуре.

Когда образуется видимая гранула, центрифугируйте клеточную суспензию и перенесите немиоцитосодержащий надосадочную жидкость в полипропиленовую коническую пробирку объемом 15 миллилитров, не нарушая гранулу миоцитов предсердий. Центрифугируйте немиоцитарную фракцию и ресуспендируйте немиоцитарную гранулу в 10 миллилитрах DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. После подсчета поместите немиоцитарные клетки с соответствующей экспериментальной плотностью для последующего анализа, затем повторно суспендируйте выделенную гранулу миоцитов предсердий в соответствующей экспериментальной концентрации для посева на культуральные планшеты, покрытые ламинином.

Для выделения желудочковых клеток измельчите ткань сердца желудочка, как только что было показано на образце ткани предсердий, и перенесите полученную клеточную суспензию в полипропиленовую коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую 2,5 миллилитров 37 градусов Цельсия в буфере, останавливающем миоциты. Промойте диссекционную пластину 2,5 миллилитрами 37 градусов Цельсия с помощью буферного буфера для остановки миоцитов и соедините промывку с клеточной суспензией. С помощью стерильной трансферной пипетки продолжайте аккуратно перемешивать и диссоциировать ткань в течение четырех минут.

В конце инкубации используйте 10 микролитров аликвоты клеток, чтобы проверить наличие палочковидных миоцитов. Пропустите клеточную суспензию через стерильный нейлоновый фильтр объемом 100 микролитров в полипропиленовую коническую трубку объемом 50 миллилитров и используйте два миллилитра ранее собранного буфера для пищеварения, чтобы смыть оставшиеся клетки из стерильного нейлонового фильтра. Дайте миоцитам желудочков осадиться под действием силы тяжести в течение шести минут с легким помешиванием, пока на дне трубки не образуется видимая гранула.

С помощью стерильного наконечника для пипетки перенесите немиоцитирующую надосадочную жидкость в полипропиленовую коническую пробирку объемом 15 миллилитров, не нарушая гранулу миоцитов желудочков, и центрифугируйте немиоцитарную фракцию. Ресуспендируйте немиоцитарную гранулу в 10 миллилитрах DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки для подсчета и наведите на клетки соответствующую концентрацию для их последующего анализа, затем ресуспендируйте выделенные миоциты желудочков в двух миллилитрах миоцитов, остановив второй буфер для подсчета. Чтобы настроить поэтапную парадигму реинтродукции кальция, добавьте 50 микролитров 10 миллимолярного хлорида кальция в суспензию клеток миоцитов желудочков с тщательным перемешиванием для четырехминутной инкубации при комнатной температуре.

По окончании инкубации добавьте в клетки дополнительно 50 микролитров 10 миллимолярного хлорида кальция при перемешивании еще в течение четырехминутной инкубации при комнатной температуре. Затем обработайте клетки одной четырехминутной инкубацией со 100 микролитрами 10 миллимолярного хлорида кальция и одной четырехминутной инкубацией с 80 микролитрами 10 миллимолярного хлорида кальция. После последней инкубации ресуспендируйте обработанные кальцием миоциты желудочков в соответствующем объеме среды для покрытия миоцитов желудочков в соответствии с их запланированным последующим анализом и засейте клетки на культуральные планшеты, покрытые ламинином.

Через час замените надосадочную жидкость средой для поддержания желудочковых миоцитов с добавлением 25 микромолярного блеббистатина. Тропонин сердечной мышцы Т является маркером сердечных миоцитов и устойчиво экспрессируется как в предсердных, так и в желудочковых культурах сердечных миоцитов. Напротив, предсердный натрийуретический пептид и вторая легкая цепь миозина устойчиво и специфично экспрессируются в культурах миоцитов предсердий и желудочков сердца соответственно.

Маркеры фибробластов экспрессируются исключительно в немиоцитарных культурах, выделенных как из предсердных, так и из желудочковых камер. Иммуноокрашивание миоцитов предсердий и желудочков взрослых мышей на маркер Т-канальцев дигидропиридина и рецептор рианодина демонстрирует интактность Т-канальцев на протяжении всей изоляции и длительного культивирования. Модель саркомерной полосатости может быть использована для оценки чистоты и жизнеспособности изолированных сердечных миоцитов в сочетании с палочковидной морфологией и ядерным окрашиванием с помощью TO-PRO-3.

Как и ожидалось, желудочковые сердечные миоциты большие, демонстрируя среднюю длину около 150 микрометров, тогда как сердечные миоциты предсердий в среднем составляют около 75 микрометров. Кроме того, при иммуноокрашивающем анализе сердечные миоциты предсердий демонстрируют устойчивую экспрессию предсердного натрийуретического пептида в характере окрашивания, характерном для локализации в эндоплазматическом ретикулуме и секреторных гранулах. В то время как предсердные миоциты секретируют предсердный натрийуретический пептид в базальных условиях, секреция увеличивается в ответ на секретагоги.

Более того, сердечные миоциты предсердий секретируют предсердный натрийуретический пептид и сосекреция перерабатывают только часть гормона из его предшественницы в продукт пептида. Наиболее распространенные ошибки, которых можно избежать, включают в себя неспособность животного сохранять спокойствие перед жертвоприношением, отсутствие удаления пузырьков воздуха из системы перфузии и неспособность самого хирурга сохранять спокойствие. После этой процедуры может быть выполнена любая общая экспериментальная процедура, включающая анализ электрофизиологических параметров и параметров обработки кальция, иммуноцитохимию, исследования гипертрофического ответа и передачи сигналов, а также исследования реперфузии симулированной ишемии.