Оптогенетическая активация афферентных путей в срезах мозга и модуляция реакций летучими анестетиками

Этот протокол может быть использован для исследования того, нарушают ли летучие анестетики одни синопсисы больше, чем другие, для определения того, являются ли их эффекты клеточным типом или специфичными для путей, а также для определения того, какие эффекты имеют место на популяционном уровне. Основным преимуществом данной методики является специфичность, с которой можно оценить эффекты летучих анестетиков. Мы можем нацеливаться на конкретные пути и типы клеток в одновременном анализе популяционной активности.

Начните с подготовки тканевого блока к разрезанию. Аккуратно поднимите мозг из полости черепа и поместите его на фильтровальную бумагу. Сделайте разрез по сагиттальной плоскости мозга параллельно средней линии и разместите тканевый блок на этой сагиттальной плоскости.

Проведите фильтровальной бумагой по блокирующему шаблону и выровняйте мозг с основным контуром шаблона. Сделайте параллельный разрез в корональной плоскости, как показано линиями на шаблоне, добавив небольшую каплю нарезки aCSF, чтобы при необходимости сохранить фильтровальную бумагу влажной. Поместите тканевый блок в четыре градуса Цельсия для нарезки aCSF и нанесите небольшое количество клея на ледяную стадию образца.

Снимите тканевый блок с нарезки аКСФ и смойте излишки раствора уголком впитывающего полотенца. Приклейте заднюю корональную плоскость тканевого блока к стадии образца так, чтобы дорсальная поверхность мозга была обращена к сапфировому лезвию. Соберите срезы коронального мозга толщиной 500 микрометров и поместите их на нейлоновую сетку при температуре 34 градуса Цельсия, нарезая aCSF.

Дайте емкости нагреться до комнатной температуры. Чтобы приготовить экспериментальные мешки с АКЧФ с растворенным изофлураном, добавьте в пустой пакетик с политетрафторэтиленом 600 миллилитров экспериментального АКЧФ и 600 мл смеси 95% кислорода и 5% углекислого газа. Наклейте на этот пакет контрольную маркировку.

Добавьте 300 миллилитров экспериментального aCSF в другой пакетик с политетрафторэтиленом газом и пометьте этот пакет изофлураном. Приступайте к приготовлению пакетика с изофлураном в соответствии с инструкциями в рукописи. Настройте протоколы моделирования света, случайным образом назначая формы волн каждому профилю.

Каждому профилю с назначенной им формой волны соответствует один импульс запуска от цифрового TTL-входа или одно испытание. По завершении сохраните последовательность профилей. Чтобы поместить многоканальный зонд в предметное стекло тканей мозга ex vivo, перфузируйте экспериментальный aCSF со скоростью от трех до шести миллилитров в минуту и перенесите срез мозга, содержащий интересующую область, на сетку в перфузионной камере микроскопа.

Закрепите срез мозга с помощью платиновой арфы. Поворачивайте сетку сетки так, чтобы линия контактов электродов на дистальном конце многоканального зонда была примерно перпендикулярна поверхности кожуры. При широком освещении поля и точном управлении микроманипулятором опустите многоканальный зонд к поверхности среза.

Задействуйте соответствующий фильтрующий куб для визуализации флуоресцентного репортерного белка, экспрессируемого в окончаниях аксонов корковых афферентов. При необходимости поверните срез, чтобы более точно выровнять щуп с поверхностью кожуры. Расположите зонд чуть выше плоскости среза на расстоянии 200 микрометров от конечного целевого положения по оси x, оставив по крайней мере один канал за пределами регистрируемой области ткани.

Медленно введите щуп в срез вдоль его продольной оси. Чтобы свести к минимуму повреждение тканей, продвигайте зонд только до такой степени, чтобы острые кончики были видны только ниже поверхности ткани. Переключите экспериментальный источник aCSF на решение для управления пакетом и определите флуоресцентно меченую ячейку для целевой записи патч-клэмпа.

Ограничьте диафрагму до наименьшего диаметра и включите высокомощный объектив для погружения в воду, стараясь избегать контакта между многоканальным датчиком и линзой объектива. Сосредоточьтесь на ткани. Центрируйте свет на участке ткани, прилегающем к многоканальному зонду, но не перекрывающем его.

Используйте соответствующий набор фильтров, чтобы обеспечить визуализацию клеток, экспрессирующих Cre-зависимый флуоресцентный маркер. Поднимите линзу объектива, чтобы освободить достаточно места для опускания патч-пипетки. Загрузите патч-пипетку с внутренним раствором и установите ее на держатель электрода.

Используйте шприц объемом в один миллилитр для приложения положительного давления, соответствующего примерно 0,1 миллилитра воздуха. Опустите патч-пипетку в раствор, сфокусировав наконечник под визуальным контролем, и получите запись всей клетки из целевой клетки. Животные, используемые в этом протоколе, экспрессировали флуоресцентный репортерный белок tdTomato либо в соматостатине, либо в парвальбумин-положительных интернейронах.

Эти интернейроны были нацелены на зажим патчей под визуальным контролем с задействованным соответствующим фильтрующим кубом. Постсинаптические потенциалы наблюдались в интернейронах в ответ на последовательность из четырех двухмиллисекундных импульсов света. Также были зарегистрированы локальные промысловые потенциалы.

Плотность источника тока и мультиединичная активность были извлечены из локальных потенциалов поля. Амплитуда поглотителей тока, извлекаемых из плотности источника тока, увеличивалась в зависимости от интенсивности света. Трехпараметрическое нелинейное логистическое уравнение было подогнано к данным для сравнения между путями.

Амплитуда постсинаптического потенциала также увеличивалась с амплитудой стока. Синаптические ответы на таламокортикальные и кортико-кортикальные входы измерялись в условиях контроля, изофлурана и восстановления. Постсинаптические реакции соматостатина и кортико-кортикальных стимулов, а также вызванные поглотители тока подавлялись в условиях изофлурана.

При приготовлении срезов мозга поддержание здоровья тканей имеет первостепенное значение. Важно, чтобы ткань оставалась прохладной на протяжении всей процедуры среза, работая быстро, не повреждая ткань. Многоканальные внеклеточные записи могут подвергаться постобработке различными способами.

Например, фильтрация высоких частот широкополосного сигнала изолирует пиковую активность населения, в то время как текущие вычисления плотности источника выделяют синаптическую активность. Вместе эти методы позволили нам изучить анестезирующее воздействие на конкретные изолированные компоненты корковых цепей, что дает представление о механизмах, лежащих в основе потери сознания in vivo.