Количественные подходы для скоринга in vivo Neuronal Aggregate и Organelle Extrusion в больших экзоферных пузырьках в C. elegans

В этом протоколе описаны подходы к обнаружению и количественной оценке крупных агрегатных и/или органелловых экструзий, производимых клетками C. elegans в виде мембранных экзоферов. Мы описываем штаммы, условия роста, критерии скоринга, сроки и соображения микроскопии, необходимые для облегчения вскрытия этого механизма высылки мусора.

Мы характеризуем механизмы in vivo агрегата и экструзии органеллы из нейронов через процесс, называемый экзоферогенезом, плохо понятую биологию, которая, вероятно, имеет отношение к распространению патологии нейродегенеративных заболеваний. Эти подходы необходимы для достижения воспроизводимых скоринга экструдированного нейрональных экзоферов и демонстрируют платформу для механистического вскрытия клеточного вывоза мусора через передачу нейронов соседним клеткам. Определение механизмов in vivo того, как нейроны выбрасывают агрегаты, может реально повлиять на разработку новых стратегий оказания помощи в лечении нейродегенеративных состояний человека.

Для базальных условий, дом C.Elegans того же биологического возраста при постоянной температуре 20 градусов по Цельсию. Для живой визуализации внутриклеточной динамики и характеристик экзофергенеза поместите до 20 животных на площадку агароса на слайде стеклянного микроскопа и обездвижьте животных. Аккуратно поместите крышку скольжения над парализованными червями и поместите слайд на стадию конфокального микроскопа флуоресценции.

Используйте цель от 10 до 40 раз, чтобы определить желаемую плоскость в Брайтфилде, записав расположение червя, ориентацию хвоста головы и расположение вульвы, которые являются ориентирами для более поздней идентификации нейронов и экзоферов. Оставаясь в той же плоскости, переключитесь на широкоугольный просмотр флуоресценции в 10-40 раз для выбранного цитосольного репортера и прокрутите в пределах оси й, чтобы наблюдать глубину животного и выражение флуоресценции в фокусной плоскости. Голова будет иметь флуоресцентное нервное кольцо, и более остроконечный хвост будет содержать от одного до двух видимых задних бокового сенсорного нейрона сомы.

Более высокое увеличение с 63x объектив может помочь определить нервное кольцо, нейронные процессы, и сома органов. В первую очередь полезно определить нервное кольцо, расположенное в голове животного и боковой нейрональных процессов. Чтобы сделать это, начните с головы червя и медленно прокрутите ось, чтобы определить плоскость нервного кольца, где нейрональные процессы прилагаются.

После того, как нервное кольцо было выявлено, в флуоресценции зрения следовать прилагается нейронального процесса боковой в задней направлении к вульве, где сома будет очевидно. После того, как круглое тело сомы или тела находятся в центре внимания, важно определить все нейроны поблизости. Для идентификации сенсорных нейронов, сначала найти ALML, ALMR, и AVM сома, которая должна быть яркими сигналами и отмечены круглым телом клетки в конце процесса.

После того, как наиболее в фокусе нейрональной сомы была обнаружена, используйте AVM-клетки, брюшной клетки, чтобы помочь назначить ориентации. Если avM нейрон находится в той же плоскости, как ALM, то животное отдыхает на его стороне и боковой нейрон ALMR. Если нейрон AVM находится не в той же плоскости, что и ALM, ближайший сенсорный нейрон к фокусной плоскости - нейрон ALML.

Также полезно определить pvM нейрон, который является брюшной сенсорный нейрон, расположенный рядом с хвостом. Фокус плоскости PVM будет указывать ли переднее касание нейрона ALML или ALMR. Если ALM в вопросе находится в той же плоскости, как PVM, то наблюдаемый сенсорный нейрон является нейрон ALML.

После того, как наиболее в фокусе ALM был определен и назначен, важно определить положение других тел сомы вблизи области интересов и во всех самолетах, чтобы не ошибить их для экзоферов. После того, как сенсорный нейрон интерес был расположен, ALMR или ALML, проверить нейрон для больших выступающих доменов экзофера, достаточно большой, чтобы считаться бутон экзофер, который, по крайней мере одна пятая размера происходящих сомы. Если не наблюдается бутон или область экзофера, проинспектировать нейрональной сомы для прилагается тонкая нить, исходящей от тела сомы.

Прикрепленные экзоферы, как правило, расположены ближе к возникают сомы и в аналогичной плоскости. Чтобы определить незакрепленный экзофер, ищите концентрированные изгнанные флуоресцентные белки, которые часто ярче сомы. Хотя изображен здесь, есть один большой экзофер.

Там может быть более одного флуоресцентного лица, происходящих из одной сомы. Ищите незакрепленные экзоферы в различных координационных плоскостях и в далекой боковой области, откуда была найдена возникаюющая сома. Экзоферы обычно выступают от сомы в заднем направлении от нейронального процесса.

Проверьте наличие крупных сферических объектов, которые не расположены и идентифицируются как нейрональные сомы. Хотя экзоферы, как правило, сфирические структуры, они могут деградировать с течением времени, приобретая более нерегулярную форму. Поиск наличия звездных ночных событий и экземпляров нескольких событий экзофера.

Чтобы избежать ошибочного и вне плоскости сомы для экзофера, очень важно идентифицировать все близлежащие тела сомы, даже вне фокуса сомы в начале наблюдения. Можно наблюдать расширенную или заостренные сомы, но расширение без четкого места сужения не должно быть засужено в качестве экзофера. Отклонить небольшие решенные почки, которые не достигают одной пятой размера сомы в количественной оценке событий экзофера.

Хотя зрелые невриты могут резко распространяться с возрастом, и флуоресцентные белки могут мигрировать в дистальный конец таких структур, не считаются нейритными нарой в качестве экзоферов. Для выявления флуоресцентных сущностей, которые не являются экзоферами, не забудьте исключить любые аутофторесценции, которые могут быть ошибочно приняты за звездный ночной везикулярный мусор под широкое поле флуоресценции. Чтобы исключить эмбриональные флуоресцентные сигналы, переключайте между флуоресценцией и освещением яркого поля, а также проверяйте на связь сигнала с яйцами в матке.

Эта таблица содержит резюме различных сенсорных нейронов, выраженных флуоресцентных репортеров, которые были использованы для мониторинга производства экзофера. Грузы, которые, как известно, экструдированы в экзоферах включают агрегаты, такие как No 128, слияние человека Хантингтон расширенный полиглутамин повторяет, лизосомы GFP помечены лизосомальных связанных мембранного белка, и митохондрии помечены матрицы локализованных GFP. Цитоплазмический GFP не сильно исключен, и преимущественно сохраняется в соме, хотя GFP может быть использован для слабой визуализации экзоферов.

В целом, производство экзофера ALMR нейрон-экспрессинг mCherry в базальных условиях начинается в первый день взрослой жизни и колеблется от примерно 5 до 25% ALMRs рассмотрены в основной экзофер производства сроки взрослого дня от одного до трех. Особые стрессы и генетические возмущения могут значительно увеличить производство экзоферов в нейронах ALMR. Очень важно, чтобы найти все близлежащие нейроны, прежде чем проверять нейрон интересов и его окрестности для экзофер доменов, нетронутыми экзоферов, или звездных ночных событий.

Когда вас устраивает ручная идентификация экзоферов, могут быть использованы усовершенствованные методы пропускной способности для крупномасштабного скрининга с использованием высококонтентной визуализации, позволяющие использовать анализ всего генома и механистическое вскрытие экзофергенеза.