Мурин модель плода воздействия материнского воспаления для изучения последствий острого хориоамнионит на развитие кишечника новорожденных

Мы разработали модель хориоамнионит для имитации воздействия плода на воспаление матери (ФЕМИ) без осложнений живых организмов для изучения влияния ФЕМИ на развитие желудочно-кишечного тракта потомства. Это позволяет изучать механистические причины развития кишечной травмы после хориоамнионит.

Этот протокол FEMI позволяет исследовать долгосрочные последствия для новорожденных после воздействия воспаления матери на плод. Это особенно актуально при развитии некротизирующего энтероколита, или НЭК. Этот метод имитирует стерильное воспаление, которое часто наблюдается при хориоамнионите, а недостаток живых бактерий может оказывать искажающее воздействие на развивающийся кишечный тракт и микробиом.

Наиболее важным этапом этого протокола является инъекция ЛПС для индуцирования FEMI. Крайне важно, чтобы использовалась соответствующая доза ЛПС и чтобы инъекция не вызвала внутрибрюшинной травмы у мыши. Начните с разбавления бульона ЛПС один к 100 стерильным физиологическим раствором до рабочей концентрации 20 микрограмм на миллилитр.

Вводят беременным самкам на день беременности Е15. Взвесьте мышей непосредственно перед инъекцией, чтобы определить подходящую дозировку ЛПС, используя эквивалентный объем обычного физиологического раствора для контрольных животных. Трижды поглотите раствор LPS в течение 15 секунд на высоком уровне.

Затем наберите его в одномиллилитровый шприц. Используйте технику загривки, чтобы удержать беременную мышь, и удерживайте ее в положении лежачей спины. Вставьте примерно от четверти до половины восьмимиллиметровой скосы иглы 30-го калибра, расположенной над правым нижним квадрантом брюшной полости под углом от 30 до 40 градусов.

Оттяните поршень шприца назад, чтобы обеспечить отрицательное давление. Затем приступайте к инъекции, если присутствует отрицательное давление. Наблюдайте за мышами в течение примерно 30 минут, а затем верните их в клетки до конца беременности.

Рожайте детенышей вагинально в E20 и позвольте им оставаться с матерями, получая кормление в неограниченном количестве. Забор кишечника осуществляется на 14-й день после рождения. С помощью ножниц и щипцов сделайте вертикальный разрез по средней линии живота, через кожу и брюшину, по всей длине живота.

Иссекаем тонкую кишку от желудка до слепой кишки, а брыжейку удаляем. Изолируйте дистальную треть тонкой кишки, отбросив проксимальную часть тонкой кишки, слепую кишку и толстую кишку. Разделите подвздошную часть пополам с помощью ножниц.

Затем поместите проксимальную половину в раствор для стабилизации РНК для количественного определения РНК, а дистальную половину в 10% нейтральном буферизованном формалине для получения предметного стекла. Разделите залитую парафином ткань на срезы толщиной пять микрометров и закрепите их на стеклянных предметных стеклах. Депарафинизируйте предметные стекла, затем окрашивайте срезы гематоксилином и эозином в соответствии со стандартными процедурами.

Используйте световую микроскопию для оценки генерализованного повреждения кишечника двумя отдельными слепыми исследователями по трехбалльной шкале, оценивая целостность ворсин и отделение от базальной мембраны. Присвойте нулевую оценку, чтобы описать нормальную слизистую оболочку. Присвойте балл 1 для описания легкой травмы, которая включает развитие субэпителиального пространства Грюнхагена, вакуолизацию или субэпителиальный лифтинг, ограниченный собственной пластинкой или кончиками ворсинок.

Присвойте балл две для описания тяжелой травмы, на которую указывают эпителиальный лифтинг и вакуолизация более половины ворсинок, деформация ворсинок или изъязвление слизистой оболочки и распад собственной пластинки. Дважды погрузите горки в ксилол на 10 минут. Затем промойте их 100% этанолом.

Погрузите предметные стекла на три минуты в 100% этанол, 90% этанол, 70% этанол и 50% этанол. Затем промойте предметные стекла под проточной водой в течение пяти минут, повернув участок в сторону от воды, чтобы предотвратить потерю образца ткани. Отфильтруйте раствор для окрашивания альцианского синего с помощью стандартного кофейного фильтра, и используйте его для окрашивания предметных стекол в течение 15 минут.

Затем промойте их под проточной водой из-под крана в течение двух минут. Разведите один миллиграмм периодической кислоты в 200 миллилитрах дважды дистиллированной воды, и погрузите стекла в этот раствор на пять минут. После минутной промывки под проточной водой испачкайте предметные стекла реагентом Шиффа в течение 10 минут, а затем снова постирайте в течение пяти минут.

Далее окрашиваем их гематоксилином в течение одной минуты, и промываем водой в течение двух минут. Погрузите их в кислый спирт на одну минуту, затем в водопроводную воду Скотта на одну минуту, после чего промойте под проточной водой из-под крана в течение одной минуты. Чтобы обезвоживать предметные стекла, окуните каждое предметное стекло 10 раз в 70% этанола, 90% этанола, а затем в 100% этанола.

Погрузите предметные стекла в 100% этанол на 10 минут, а затем дважды погрузите в свежий ксилол на три минуты каждый раз. Положите каплю монтажного материала на образец и покровный стекло сверху. Подсчитайте бокаловидные клетки под микроскопом.

Для каждого кусочка кишечной ткани подсчитайте количество бокаловидных клеток и 500 эпителиальных клеток. Затем сцеживайте бокаловидные клетки в соотношении на 100 эпителиальных клеток. Подсчитайте ячейки Панета.

Для каждого кусочка кишечной ткани запишите соотношение клеток Панета на кишечную крипту, насчитав 100 кишечных крипт на каждый кусок кишечной ткани. Воздействие на плод материнского воспаления, или FEMI, на 15-й день эмбрионального периода приводит к дозозависимой потере беременности и дозозависимой частоте преждевременных родов. FEMI вызывает значительное повреждение кишечника при рождении и на восьмой неделе жизни.

Это повреждение происходит при отсутствии каких-либо дополнительных стимулов у животных, что позволяет предположить, что FEMI сам по себе нарушает нормальный гомеостаз кишечного тракта новорожденных мышей. Количественно оценивали количество муцин-продуцирующих бокаловидных клеток и антимикробных пептид-продуцирующих клеток Панета в дистальной трети тонкого кишечного тракта. Было обнаружено, что FEMI нарушает нормальный состав кишечного эпителия, вызывая потерю обоих типов клеток, по сравнению с животными без FEMI.

Для изучения влияния FEMI на воспалительную реакцию новорожденных были количественно оценены различные маркеры воспаления в сыворотке крови, включая интерлейкин-1 бета, интерлейкин-10, KCGRO и интерлейкин-6, из сыворотки крови щенков с FEMI и без него. FEMI значительно увеличивал воспалительный каскад для всех цитокинов на уровне P0. Воспалительный каскад в более позднем возрасте различался в зависимости от временной точки и цитокина. Интересно, что аналогичные уровни IL6 на уровнях от P7 до P28 наблюдались в группах FEMI и фиктивных группах.

Тем не менее, в группе FEMI на уровне P56 наблюдались значительно более высокие уровни, несмотря на отсутствие вторичного вмешательства. Очень важно выполнить начальную кривую дозы ЛПС, так как разные запасы ЛПС могут иметь разную потенцию. Мы обнаружили, что наши неонатальные исходы зависят от дозы ЛПС, используемой для индуцирования FEMI.