Подготовка тунца внеклеточной матрицы микроэковранции для оценки Шванн клеток фенотип спецификации

Этот протокол обеспечивает платформу клеточной культуры, где свойства внеклеточной матрицы, такие как жесткость, состав белка и морфология клеток, могут быть точно проутмлены экономически эффективным и поверхностным образом. Метод является экономически эффективным и не требует специальной подготовки или оборудования. Он также совместим с несколькими клеточными методами количественной оценки, такими как иммунофлуоресцентное окрашивание и западная помарка.

Этот метод обеспечивает механистическое понимание биологии клеток Шванн. С дополнительным пониманием биоматериала дизайн для регенерации нервной системы, он может быть применен к любой якорной зависимых клеток. Наиболее сложной частью этого протокола является микроконтактная печать.

До начала протокола микроконтактная печать на субстрате с помощью флуоресцентного тега белка визуально проверяет окончательный отпечаток на узор. Начните с энергичного смешивания базового елатомера PDMS и лечения агентов кончиком пипетки до тех пор, пока пузырьки не будут однородно рассредоточены внутри смеси. Затем удалите пузырьки с вакуумной высыхания.

Поместите каплю высушенной смеси PDMS на квадратную или круговую крышку и поверните крышку на спиновом пальто при 2500 об/мин в течение 30 секунд. Инкубировать крышку либо в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию, в течение одного-двух часов, или при комнатной температуре на ночь. Чтобы подготовить микро-узорчатый субстрат, поместите узорчатую кремниевую пластину внутри круговой 150-миллиметровой диаметром на 15 миллиметров высотой чашки Петри и вылейте де-газированную PDMS на пластину.

Затвердеть PDMS в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию на ночь. Дайте PDMS остыть до комнатной температуры. Затем используйте хирургический скальпель, чтобы вырезать марки 30 на 30 миллиметров квадратов, содержащих правильные узоры, заботящиеся, чтобы не повредить кремниевую пластину.

Стерилизовать марки PDMS и настраиваемую крышку скользит, погружая их в 70% этанола в течение 30 минут. Чтобы подтвердить эффективность микропаттерна, высушите поверхность марок PDMS с помощью фильтрованного воздушного потока и пипетки 15 микрограмм на миллилитр BSA раствор для покрытия всей узорчатой стороне марки. Инкубировать марки с раствором BSA в течение одного часа при комнатной температуре, чтобы обеспечить белок adorption, а затем воздух сухой марки, чтобы удалить решение BSA.

Используйте фильтрованный поток воздуха, чтобы высушить поверхность настраиваемой крышки скользит. Принесите узорчатую сторону штемпеля в конформный контакт с tuneable coverslip для того чтобы позволить для BSA adsorption на поверхности coverslip, и нежно отжмите штемпеле против coverslip на 5 минут. Изучите микропаттерн с помощью флуоресцентного микроскопа с помощью фильтра FITC.

Для печати клеточных клеевых областей, а не флуоресцентных моделей заменить ламинин для белка BSA. Снимите штампы с крышки скользит и передать крышку скользит в стерилизованной шесть хорошо пластины. Добавьте два миллилитров раствора 0,2%Pluronic F-127 в каждую колодец, чтобы покрыть поверхность крышки скольжения и инкубировать пластину в течение одного часа при комнатной температуре.

Аспирировать F-127 раствор и мыть крышку скользит пять раз с PBS, один раз с клеточной культуры среды, а затем семян клеток Шванн на плотность посева 1000 клеток в сантиметрах в квадрате. Через 45 минут после посева клеток, удалить клеточной культуры среды и мыть крышку скользит дважды с PBS, чтобы предотвратить несколько клеток от соблюдения той же модели. Поддержание клеток в желаемой среде клеточной культуры в течение 48 часов до количественной оценки.

Для создания линейных клеточных культур субстратов для изучения выровненных клеток, сделать марки в соответствии с рукописными указаниями, и сократить их до желаемых размеров. Подготовь две чашки Петри, покрытые настраиваемой поверхностью PDMS, как описано ранее, и выполняем микроконтактную печать для печати линейных клеточных клеевых зон на одном из блюд. После снятия штампов заполните чашку Петри четырьмя миллилитровами по 0,2%Плуронический раствор F-127 и инкубировать его в течение часа.

Промыть каждую сторону марки PDMS три раза с 70%этанола и высушить его с воздухом. Поверните марки PDMS и напечатайте непаттернированную область клея ячейки на второй чашке Петри, как описано ранее. После инкубации блюд с раствором F-127, удалить раствор и мыть посуду три раза с PBS и один раз со свежей среды культуры клеток.

Затем семенные клетки на посуде, и поддерживать их в желаемых условиях в течение 48 часов перед приготовлением ликатов. Чтобы подготовить лизаты, промыть клетки ледяным PBS в течение двух минут, затем добавить 80 микролитров раствора RIPA, подготовленных в соответствии с рукописными указаниями, на каждую область клея клетки, и инкубировать клетки на ледяной глыбе в течение 25 минут. Очисти клетки Шванн с клеточным скребок в течение пяти минут и собирать лизат в помечены 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки.

Центрифуга лисировать в течение 15 минут при 12 тысяч раз G и четыре градуса по Цельсию. Соберите супернатант и перенесите его в чистую трубку микроцентрифуга. Субстраты с покрытием ламинина привели к более высокому уровню пролиферации по сравнению с коллагеном и фибронектином с покрытием субстратов.

Клетки Шванн на субстратах с ламининым покрытием и различными модули показали, что относительно мягкие субстраты снизили показатели пролиферации клеток. Клетки также были проанализированы для экспрессии протеина. Транскрипционные фактор c-Jun выражение было upregulated по мере того как substrates стали более мягкими.

Тем не менее, он был значительно ниже регулируется на самых мягких субстратов. На жестких субстратах субстраты с коллагеновым покрытием привели к самому высокому экспрессии c-Jun, так как субстраты стали мягче, ламинин показал самый высокий уровень c-Jun. Клетки были затем окрашены родамин-фаллоидин, чтобы исследовать роль распространения клеток и области в c-Jun выражение.

Когда клеточные клеевые линии были созданы на подложки клеточной культуры, коэффициент ядерного аспекта клеток, посеянных на подложки шаблона, увеличивался по сравнению с клетками на непаттернированных субстратах. Выражение рецептора нейротрофина c-Jun и p75 регулировалось в плотных клетках с меньшей областью распространения. Линейные клетки также привели к более высокому выражению как c-Jun, так и p75 NTR по сравнению с непаттернативными клетками.

Микроконтактные печатные клеточные клеевые геометрии были созданы для точного контроля области распространения клеток и удлинения при одновременном устранении взаимодействия клеток с клетками. Увеличение коэффициента клеточного аспекта привело к увеличению ядерного удлинения. Выражение c-Jun было upregulated и клетчатым удлинением и ингибированием распространения клетки.

Иммунофторесценция окрашивания как для ядер, так и для актина подтвердила, что область распространения клеток и удлинение были точно проконтрены с помощью этого метода микропаттернации. Этот метод проложил путь к использованию наших настраиваемых субстратов в качестве метода механистического анализа биологии клеток Шванн и сигнализации в контексте регенерации и рака.