Биоинформатический конвейер для исследования молекулярной эволюции и экспрессии генов с использованием RNA-seq
28 мая 2021 г.
Целью этого протокола является исследование эволюции и экспрессии генов-кандидатов с использованием данных секвенирования РНК.
Этот протокол описывает биоинформативные шаги для исследования молекулярной эволюции и экспрессии генов-кандидатов. Здесь мы предоставляем подробные инструкции, чтобы любой человек с минимальным биоинформатическим опытом мог пройти через этот протокол. Этот конвейер может быть применен к любому организму и любому семейству генов.
Одной из распространенных проблем при выполнении биоинформатики является сбой сценариев оболочки. При попытке использования этого протокола убедитесь, что у вас есть самое современное программное обеспечение, прочитайте файлы ошибок и внимательно проверьте руководство. Для начала войдите в учетную запись кластера компьютеров в окне терминала или приложения PuTTY.
На терминале загрузите SRA Toolkit версии 2.8.1 с помощью Wget, после чего завершите установку программы. Выполните поиск NCBI по номеру присоединения SRA для требуемых образцов, а затем получите данные последовательности РНК в окне терминала. Получите два файла FASTQ для парного типа файлов.
Найдите эталонный геном онлайн, если он существует. Чтобы получить эталонную сборку, введите wget в окне терминала и вставьте адрес ссылки. Если доступно, также скопируйте файл GTF и файл белка FASTA для эталонного генома.
Индексируйте геном, затем считывает карту и вычисляет экспрессию для каждого образца. Переименуйте файл результатов во что-то описательное и создайте матрицу всех счетчиков. Откройте окно интернет-браузера и перейдите в NCBI GenBank.
В строке поиска введите название интересуемого гена и название близкородственных видов, которые были секвенированы. В левой части строки поиска выберите Белок, затем нажмите Кнопка Поиск. Извлеките последовательности, нажав кнопку Отправить, а затем выберите Файл.
В разделе Формат выберите FASTA, затем нажмите Создать файл. Переместите файл гомологов FASTA в кластер компьютеров с помощью локального окна терминала или FileZilla. Затем найдите гены-кандидаты с помощью BLAST+ On компьютерного кластера, сделайте базу данных BLAST из генома или транскриптом-транскриптомного белка, FASTA.
BLAST гомологичные последовательности генов из NCBI в базу данных интересующих видов, затем просмотрите выходной файл с помощью команды more. Скопируйте уникальные идентификаторы генов интересующих видов в новый текстовый файл. Извлеките последовательности генов-кандидатов.
Чтобы подтвердить аннотацию гена с помощью Reciprocal BLAST, перейдите в инструмент поиска локального выравнивания BLAST, выберите BLASTP, затем вставьте последовательности-кандидаты, выберите базу данных неизбыточных белковых последовательностей и нажмите кнопку BLAST. Откройте MEGA, нажмите «Выровнять», затем «Изменить выравнивание сборки», выберите «Создать новое выравнивание» и нажмите «ОК». Выберите Белок. Когда откроется окно Выравнивание, нажмите кнопку Изменить.
Нажмите Кнопку Вставить последовательности из файла и выберите FASTA с белковыми последовательностями генов-кандидатов и вероятными гомологами. Выберите Все последовательности. Найдите символ руки и наведите на него курсо.
Следует сказать, выровнять последовательности с помощью мышечного алгоритма. Щелкните символ руки, а затем щелкните Выровнять белок, чтобы выровнять последовательности Изменить параметры, или нажмите кнопку ОК, чтобы использовать параметры по умолчанию. Этот протокол был применен к тканям Hydra vulgaris, которая является пресноводным беспозвоночным, принадлежащим к типу Cnidaria.
Гены опсина были исследованы, чтобы получить представление об эволюции глаз и обнаружении света у животных. Последовательности для генов H.vulgaris и других видов, связанных с опсином, были извлечены в файл FASTA из NCBI GenBank. Гены опсина были выровнены в MEGA, что позволило идентифицировать опсины гидры, в которых отсутствовала аминокислота с сохраненным лизином, необходимая для связывания светочувствительной молекулы.
Дерево максимальной вероятности было сгенерировано с использованием последовательностей опсина от Hydra vulgaris и других видов. Филогенез предполагает, что гены опсина развиваются путем специфических для линии дупликации у книдариев и, возможно, путем тандемной дупликации у H.vulgaris. Затем в edgeR был проведен дифференциальный экспрессионный анализ для исследования абсолютной экспрессии генов опсина.
Чтобы определить, регулируется ли один или несколько опсинов в гипостоме или голове, были проведены парные сравнения гипостома с колонкой тела, зоной почкония, стопой и щупальцами. Было обнаружено, что 1 774 транскрипта были дифференциально выражены между гипостомой и колонкой тела. Были определены гены, которые регулировались в ходе нескольких сравнений, и было выполнено функциональное обогащение в Blast2GO.
Наконец, абсолютная экспрессия генов опсина исследовалась в разных тканях на разных стадиях бутонации и в разные временные точки регенерации. Визуальный осмотр выравнивания и дерева подтвердит, принадлежат ли гены-кандидаты к интересующее семейство. Гены, которые слишком отличаются по последовательности или группе вне всего остального, вероятно, являются частью другого семейства генов.
Результаты этого протокола можно считать гипотезообразующими. Этот конвейер может выделить гены-кандидаты для функционального изучения в будущих исследованиях. После изучения экспрессии опсина гидры мы теперь используем аналогичные методы для исследования родственных генов у разных видов, чтобы определить сходства и различия в функциях.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе исследуются молекулярная эволюция и экспрессия генов-кандидатов с использованием данных секвенирования РНК, при этом особое внимание уделяется генам опсинов у Hydra vulgaris. В исследовании представлен биоинформатический конвейер, который может быть применен к различным организмам.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Анализ экспрессии генов
- Молекулярная эволюция
- Биоинформатика
Теоретическая часть
- Исследование генов-кандидатов, связанных с детекцией света и эволюцией глаза
- Использование пресноводного беспозвоночного Hydra vulgaris
- Применение ресурсов NCBI для получения данных о последовательностях
Используемые методы
- Биоинформатический конвейер для секвенирования РНК
- Hydra vulgaris в качестве биологической системы
- Инструменты BLAST, MEGA и edgeR для анализа
Основные результаты
- Идентифицированы гены опсинов, эволюционировавшие путем специфичных для линий дупликаций у Cnidaria
- Обнаружена дифференциальная экспрессия 1774 транскриптов в различных частях тела
- Построено филогенетическое дерево последовательностей опсинов методом максимального правдоподобия
Выводы
- Протокол подчеркивает потенциал генов-кандидатов для будущих функциональных исследований
- Расширяет наше понимание эволюции и экспрессии генов в контексте сенсорной биологии
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный биоинформатический конвейер позволяет систематически исследовать эволюцию и экспрессию генных семейств, обеспечивая валидацию мишеней путем механистического снижения рисков на ранних этапах поиска. Интеграция филогенетического анализа с количественным определением методом RNA-seq обеспечивает прогностическую уверенность при приоритизации генов-кандидатов с консервативными или дивергентными функциями у разных видов. Этот подход способствует сортировке портфеля за счет формулирования гипотез, основанных на механизмах действия, до выделения ресурсов на функциональные исследования.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем уточнения ортологии генов и эволюционных связей внутри целевых семейств.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством сравнительного профилирования экспрессии в различных тканях и на разных стадиях развития.
- Прогностическая ценность: способствует идентификации перспективных кандидатов за счет выявления генов с lineage-специфичными экспансиями и паттернами экспрессии, обогащенными в определенных тканях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных наборов генов для последующего скрининга путем подтверждения принадлежности к семейству с помощью выравнивания последовательностей и топологии дерева.
- Практическая ценность: Создание стандартизированных матриц подсчетов на основе данных RNA-seq, что обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для подготовки анализа.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы для разных организмов за счет применения единых рабочих процессов BLAST, выравнивания и филогенетического анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь данных об экспрессии на этапе поиска с доклиническими моделями путем выявления консервативных паттернов экспрессии в соответствующих тканях.
- Согласование биомаркеров: способствует поиску трансляционных биомаркеров с помощью анализа дифференциальной экспрессии в различных условиях, например, при сравнении гипостома и ствола тела у Hydra.
- Прогресс с учетом рисков: обосновывает решения о целесообразности дальнейшего проведения исследований (go/no-go), раскрывая динамику экспрессии на стадиях регенерации и почкования, что указывает на функциональную значимость.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в непрерывный процесс поиска — от идентификации мишени до оптимизации ведущих соединений, обеспечивая гипотетически обоснованный переход от анализа последовательностей к функциональной приоритезации.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез путем построения филогенетических деревьев, которые выявляют события дупликации и селективное давление на интересующие семейства генов.
- Скрининг: позволяет получать готовые для анализа биологические системы с помощью нормализованных матриц экспрессии, обеспечивающих возможность межобразцового сравнения активности генов.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение зависимых переменных посредством анализа дифференциальной экспрессии на основе edgeR, что позволяет проводить статистическое сравнение условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями путем идентификации генов с консервативными функциями в сенсорных системах различных многоклеточных животных (metazoans).
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемый биоинформатический инструментарий для анализа любого семейства генов, сокращая необходимость в повторной разработке конвейеров обработки данных для разных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при выборе мишеней за счет снижения механистической неопределенности с помощью анализа эволюционного контекста и контекста экспрессии.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря документированным пошаговым биоинформатическим процедурам, применимым в разных исследовательских группах.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, обеспечивая раннее снижение рисков при выборе мишеней до начала инвестиций в лабораторную валидацию.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков, выделяя гены с выраженной эволюционной консервативностью и тканеспецифической индукцией.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области биоинформатики, включая владение инструментами командной строки, базами данных последовательностей и программным обеспечением для филогенетического анализа.
- Необходимо наличие доступа к вычислительной инфраструктуре для обработки больших наборов данных RNA-seq и проведения анализа с использованием BLAST, MEGA и edgeR.
- Требуется межкомандная стандартизация именования файлов, версий референсного генома, а также параметров выравнивания и построения деревьев.
- При применении данного конвейера к немодельным организмам с неполными геномами или аннотациями необходимо учитывать особенности адаптации метода.
- Результаты ограничены качеством и полнотой входных данных, включая глубину секвенирования RNA-seq и точность аннотации референсного генома.
