Подготовка и инъекция эмбрионов комаров Culex для генерации нулевых мутаций с использованием CRISPR/Cas9
10 сентября 2020 г.
CRISPR/Cas9 все чаще используется для характеристики функции генов в немоделизованных организмах. Этот протокол описывает, как генерировать нокаутирующие линии Culex pipiens,от приготовления инъекционных смесей до получения и инъекции эмбрионов комаров, а также как заводить, скрещивать и проверять введенных комаров и их потомство на желаемые мутации.
Этот протокол важен, потому что он содержит подробные инструкции о том, как готовить и вводить эмбрионы комаров для редактирования генома CRISPR-Cas9. Основные преимущества этой техники микроинъекций заключаются в том, что она имеет высокий уровень выживаемости комаров и позволяет исследователям определить функцию гена. Этот протокол был специально разработан для инъекций комаров, принадлежащих к роду Culex.
Эти комары переносят несколько патогенов, в том числе вирусы, вызывающие лихорадку Западного Нила и энцефалит Сент-Луиса, а также филяриальные нематоды, вызывающие собачий сердечный червь и слоновость. Таким образом, наличие таких инструментов, как редактирование генома CRISPR-Cas9, позволит нам лучше понимать и контролировать эти важные факторы заболевания. Введение свежеотложенных эмбрионов насекомых и повышение выживаемости требует много времени, практики и терпения.
Поэтому мы рекомендуем вводить несколько эмбрионов цветным солевым раствором перед введением дорогостоящих материалов для генерации мутации. Начните с обратной засыпки инъекционных игл смесью для инъекций. Выберите наполнитель иглы или наконечник для загрузки геля, который легко поместится в заднюю часть выбранной иглы для инъекций.
Убедитесь, что между концом наполнителя иглы и иглой для инъекций остается немного места. Осторожно аспирируйте, одну маленькую каплю инъекции смешайте с иглой для инъекции возле того места, где она начинает сужаться. Затем прикрепите инъекционную иглу к микроинъектору.
Поместите предметное стекло с эмбрионами на предметное стекло микроскопа. Чтобы открыть иглу, используйте начальное давление впрыска примерно 30 фунтов на квадратный дюйм и отрегулируйте его по мере необходимости, чтобы подать соответствующий объем инъекционной смеси. Под диссекционным микроскопом расположите иглу над эмбрионом комара и осторожно с помощью микроманипулятора опустите иглу на эмбрион.
Как только игла едва коснется эмбриона, быстро переместите эмбрион перпендикулярно длинной оси иглы. Чтобы определить, была ли игла успешно открыта, нажмите на спусковой крючок инъекции и посмотрите, не выйдут ли пузырьки или инъекционная смесь из иглы. Если нет, повторите перемещение эмбриона комара по игле до тех пор, пока она не откроется и смесь для инъекций не выйдет при нажатии на спусковой крючок.
Расположите первый эмбрион комара в центре обзора, убедитесь, что он находится в фокусе, и поместите иглу над первым яйцом. Постепенно увеличивайте увеличение на микроскопе, осторожно опуская иглу так, чтобы она находилась чуть выше первого эмбриона. Продолжайте до тех пор, пока микроскоп не достигнет своего максимального увеличения, и пока эмбрион и игла не окажутся в фокусе.
Сдвиньте эмбрион немного влево и опустите иглу так, чтобы он находился в той же плоскости обзора, что и эмбрион. С помощью предметного столика микроскопа осторожно прикоснитесь эмбрионом к кончику иглы. Узкий задний конец эмбриона комара должен немного отклоняться.
С помощью предметного столика под микроскопом переместите задний конец эмбриона на иглу и наблюдайте, как игла проникает в хорион яйца комара. Игла должна как раз проникать в мембрану и приблизительное расположение полюсных клеток внутри эмбриона. Размещение инъекционной смеси в этой области увеличивает вероятность того, что мутации произойдут и будут наследоваться в зародышевой линии.
Нажмите на спусковой крючок инъекции от одного до трех раз, чтобы выстрелить инъекционной смесью в эмбрион. Введите небольшое количество инъекционной смеси, достаточное для того, чтобы можно было обнаружить небольшое очищение в плазме эмбриона. Используйте эту стадию, чтобы переместить эмбрион вправо, подальше и с кончика иглы.
Если инъекция прошла хорошо, жидкость практически не должна вытекать из эмбриона. Сдвиньте стадию вниз так, чтобы следующий эмбрион располагался перед иглой. И повторите инъекцию.
Если инъекционная смесь не выходит или если большое количество жидкости выходит из эмбриона после удаления иглы, замените инъекционную иглу и начните сначала. Уничтожьте все неинъецированные или поврежденные яйца. После того, как все эмбрионы на предметном стекле были введены, смойте галоуглеродное масло, применив воду обратного осмоса с помощью пульверизатора.
Направьте струю воды на верхнюю часть стеклянной крышки над введенными эмбрионами и дайте воде стечь вниз по защитной крышке, следя за тем, чтобы струя не направлялась на эмбрионы. Налейте на предметное стекло 150 микролитров воды и положите его на влажную фильтровальную бумагу внутри квадратной чашки Петри. Инкубируйте чашку Петри в камере для окружающей среды, установленной на 25–27 градусов Цельсия и относительной влажности от 70 до 80% с длительным фотопериодом.
Этот протокол был использован для успешной инъекции эмбрионов северного домового комара, Culex pipiens, гарантируя, что передний конец эмбриона комара выходит за пределы полосы медицинской повязки, что значительно увеличивает выживаемость личинок и приводит к получению высококачественного потомства, способного развиваться до взрослого возраста и размножаться. Секвенирование показало, что примерно у 10% обследованных комаров наблюдалась небольшая вставка или делеция вблизи места разреза Cas9 первой направляющей РНК, что позволяет предположить, что полюсные клетки были успешно нацелены во время микроинъекций. Особи F1 успешно спаривались и производили жизнеспособное потомство, некоторые из которых также содержали мутацию.
При микроинъекции эмбрионов насекомых большинство людей испытывают трудности с первоначальным открытием иглы и перемещением эмбриона на иглу. Помните, что развитие этих навыков требует времени и практики. Этот протокол может быть изменен или адаптирован для инъекции эмбрионов других комаров или даже других видов насекомых.
Помимо использования этого протокола для нокаутирования генов с помощью целевого редактирования генома CRISPR-Cas9, те же методы могут быть использованы для введения плазмид или транспозонов либо в нокаутирующие гены, либо для генерации случайных мутаций. В настоящее время моя лаборатория использует этот метод, чтобы лучше понять, как комары измеряют ежедневно и регулируют свои сезонные реакции. Тем не менее, как мы, исследователи, используем редактирование генома CRISPR-Cas9, чтобы лучше понять биологию нескольких организмов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 для создания нокаутных линий Culex pipiens — вида комаров, переносящих несколько видов патогенов. В работе подробно описаны процессы подготовки и инъекции эмбрионов комаров, что позволяет обеспечить высокий уровень выживаемости и облегчить анализ функций генов.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Редактирование генома CRISPR/Cas9
- Контроль переносчиков и профилактика заболеваний
- Эмбриология насекомых
Теоретические основы
- Culex pipiens является важным переносчиком нескольких заболеваний.
- Идентификация функций генов имеет решающее значение для понимания механизмов передачи патогенов.
- Методы микроинъекций повышают эффективность генетических модификаций.
Используемые методы
- Микроинъекция эмбрионов комаров
- Culex pipiens в качестве биологической модели
- Система CRISPR/Cas9 для направленного редактирования генома
Основные результаты
- Успешная инъекция привела к тому, что примерно у 10% проскринированных комаров проявились целевые мутации.
- Были достигнуты высокие показатели выживаемости личинок, что позволило получить жизнеспособное потомство.
- Мутации наследовались через зародышевую линию у особей поколения F1.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует возможность использования системы CRISPR/Cas9 для изучения функций генов у Culex pipiens.
- Данный протокол имеет важное значение для стратегий контроля переносчиков при борьбе с заболеваниями.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Редактирование генов с помощью системы CRISPR/Cas9 у комаров — переносчиков заболеваний позволяет проводить валидацию мишеней и функциональный геномный анализ для изучения передачи патогенов. Данный протокол способствует снижению механистических рисков путем установления зародышевой передачи мутаций у Culex pipiens, основного переносчика вируса Западного Нила и филяриазных нематод. Этот подход представляет собой масштабируемую платформу для фенотипического скрининга и идентификации перспективных мишеней в исследованиях по контролю переносчиков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функцию генов в переносчиках-комарах для валидации мишеней, участвующих в передаче патогенов.
- Операционная ценность: обеспечивает уровень мутаций примерно 10% в проанализированных эмбрионах, что поддерживает эффективность рабочих процессов валидации мишеней.
- Прогностическая ценность: передача мутаций по зародышевой линии потомству F1 подтверждает активность в целевой области и наследуемость для оценки фенотипа.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Микроинъекция комплексов Cas9/гРНК в эмбрионы позволяет создавать сайт-направленные мутации для функционального скрининга.
- Практическая ценность: Высокая выживаемость эмбрионов после инъекции обеспечивает возможность масштабируемого скрининга инъецированных когорт.
- Готовность анализа: Протокол включает подготовку иглы, выравнивание эмбрионов и параметры инъекции для обеспечения воспроизводимости результатов в разных сериях опытов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Созданные мутантные линии позволяют изучать роль генов в векторной компетенции в отношении таких патогенов, как вирус Западного Нила и филяриазные нематоды.
- Механистическое снижение рисков: Мутации, наследуемые в зародышевой линии, позволяют проводить лонгитюдный фенотипический анализ на протяжении нескольких поколений.
- Релевантная модель заболевания: Модель Culex pipiens позволяет оценивать генетические мишени, значимые для стратегий контроля переносчиков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум от открытия до доклинических исследований, обеспечивая возможность валидации мишеней, фенотипического скрининга и последующего изучения механизмов в переносчиках заболеваний из числа насекомых.
- Открытия в биологии: Обеспечивает проверку гипотез с помощью нокаута генов для выяснения их роли в путях передачи патогенов.
- Скрининг: Позволяет получать количественные данные о мутациях (например, частоту инделей) для сравнения эффективности gRNA и эффективности редактирования.
- Аналитика: Секвенирование особей F0 и F1 обеспечивает измеримые результаты для оценки точности редактирования и передачи по зародышевой линии.
- Трансляционные исследования: Мутантные линии облегчают доклиническую оценку функции генов в компетентности векторов и взаимодействии с патогенами.
- Корпоративное повторное использование: Стандартизированный рабочий процесс микроинъекций может быть адаптирован для различных видов комаров и моделей насекомых для повторного использования платформы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность в валидации мишени с помощью мутаций, передающихся в зародышевой линии, и фенотипического скрининга.
- Операционная ценность: Высокие показатели выживаемости и воспроизводимые параметры инъекций повышают пропускную способность и сокращают потери ресурсов.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать решения о целесообразности (go/no-go) приоритизации мишеней путем установления связи между функцией гена и компетентностью вектора.
- Влияние на портфель: Продвижение кандидатов для контроля переносчиков с поправкой на риск на основе валидированных механистических данных.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области эмбриологии комаров, методах микроинъекций и приготовления реагентов для системы CRISPR/Cas9.
- Зависит от наличия аппаратуры для микроинъекций, установки для микроскопии и средств контроля условий окружающей среды для инкубации эмбрионов.
- Необходима стандартизация между группами исследователей в вопросах обращения с эмбрионами, давления при инъекции и подготовки игл для обеспечения воспроизводимости результатов.
- Адаптация метода для других видов комаров может потребовать оптимизации сроков сбора эмбрионов и параметров инъекции.
- Практические ограничения включают зависимость от технических навыков при раскрытии игл и выравнивании эмбрионов, что влияет на эффективность инъекций.
