Кристаллизация белков на чипе с помощью микродиализа для рентгеновских исследований In Situ

В этой статье описывается протокол изготовления микрофлюидных чипов, разработанных для кристаллизации белка на чипе с помощью метода диализа и экспериментов по рентгеновской дифракции на месте при комнатной температуре. Одним из основных преимуществ этих микрочипов является выбор производственных материалов, что делает чипы совместимыми для сбора данных рентгеновской дифракции in situ при комнатной температуре. Эксперименты по кристаллизации на чипе требуют небольших объемов образца белка, снижая общую стоимость работы с этими макромолекулами высокой стоимости.

Кристаллизация на чипе также устраняет ручную уборку хрупких кристаллов белка, часто применяемых в сочетании с криоохлажданием во время обычных экспериментов по кристаллографии. Кроме того, наши микрочипы используют микродиализ для кристаллизации белка, который является методом на основе диффузии, направленным на эквилибрирование резкой концентрации через полупроницаемую мембрану, для того, чтобы приблизиться к концентрации кромулента для кристаллизации белка, и позволяет точно и обратимо контролировать условия кристаллизации. Микродиализ в сочетании с контролем температуры может быть использован для разъединения нуклеации от роста кристалла для исследования фазовых диаграмм, путем изменения концентрации осадков при использовании того же образца белка.

Сначала приготовьте 50 граммов силикона PDMS базы, и это лечение агента в соотношении 10 к одной массе. Смешайте два ингредиента в стакане с помощью шпателя. После смешивания поместите смесь в вакуумную камеру, чтобы удалить все пузырьки воздуха.

Положите 25 граммов предварительно смешанных PDMS в первый SU8 освоить содержащие модели микрофлюидного канала и столбов, до высоты около пяти миллиметров. Затем вылейте оставшиеся 25 граммов PDMS во второй мастер SU8, содержащий только узоры столбов. Лечить два слоя PDMS в духовке на 338 кельвинов в течение одного часа.

Вырежьте вылеченные слои PDMS вокруг узоров мастеров SU8 скальпелем и аккуратно снимите формы PDMS с силиконовых мастеров. Поместите форму PDMS, показывая как каналы, так и столбы на жестком стеклянном слайде микроскопа с узорами, обращенные вверх. Вырезать небольшой кусочек регенерированных целлюлозы диализной мембраны для того, чтобы покрыть центральный столп формы PDMS, который предназначен для белковой камеры.

Молекулярное отрезание веса мембраны диализа выбрано соответственно к молекулярному весу образца протеина, и обрывам раствора кристаллизации. Затем тщательно отделить сухой кусок регенерированных целлюлозной диализной мембраны. Вырежьте небольшой кусочек отделенной диализной мембраны.

Размер этого куска мембраны зависит от конструкции чипа. И, в частности, это зависит от размеров центральной опоры. Депозит кусок мембраны диализа на центральном столбе формы PDMS, которая поддерживается на стеклянной горке, с ее столбом и каналами, обращенными вверх.

Затем поместите вторую форму PDMS с изображением только столбов, обращенных вниз, на верхней части формы PDMS, которая уже поддерживается на стеклянной горке. Выровнять все столбы двух форм PDMS. Кусок регенерированных целлюлозно-диализной мембраны зажат между двумя центральными столпами форм PDMS.

Этот этап процедуры изготовления может быть проведен под оптическим микроскопом или просто путем визуального осмотра тщательного выравнивания всех столбов. Поместите сборку в вакуумную камеру и высасывай в течение 30 минут для того, чтобы удалить захваченные пузырьки воздуха в формы PDMS, и для повышения вставки фотокуримой смолы NOA, которые будут описаны на следующем этапе этого протокола. Удалите сборку из вакуумной камеры и заполните пустое пространство между двумя формами PDMS с фотокабельной смолой на основе тиолина, NOA 81, капиллярной впитываемой смолой.

Нанесите смолу на три из четырех сторон сборки. Поместите сборку в поперечный связующий и вылечить смолы NOA, подвергая УЛЬТРА-излучения в течение восьми секунд, используя коллимированные УФ-лампы 35 милливатт на квадратный сантиметр. Вырезать 175 микрометров толщиной PMMA кусок в стандартных размерах микроскопа стеклянный слайд, и снять пластиковую защиту с каждой стороны части PMMA.

После того, как первый УФ-облучения завершена, удалить верхнюю форму PDMS с частично кросс-связанных NOA смолы застрял на нем из нижней формы PDMS и стеклянный слайд. Нажмите осторожно сборки верхней формы PDMS и частично вылечить noA смолы на Кусок PMMA. Поместите новую сборку в кросс-линкер и вылечить снова смолы NOA путем воздействия УФ-излучения в течение 60 секунд.

Удалите тщательно верхней формы PDMS. Диализ чип из полностью кросс-ссылка NOA смолы встраивания регенерированных целлюлозно-диализной мембраны и поддерживается на PMMA кусок готов. Связь коммерчески доступных разъемов на входе и розетке точек микрофлюидного канала с быстрым эпоксидным клеем.

Для обработки жидкости выберите диаметр труб PTFE в зависимости от размера разъемов. Трубки используются для введения раствора кристаллизации в жидком канале чипа диализа. Пипетка вручную капля образца белка внутри белкового резервуара, расположенного прямо на мембране диализа.

Объем капли белка зависит от конструкции используемого микрочипа. А конкретно, это зависит от объема центральной опоры, а может быть 0,1 или 0,3 микролитера. Аккуратно нанесите тонкий слой высокой вакуумной силиконовой смазки по всему белковому резервуару.

Вырезать небольшой кусочек PMMA и аккуратно поместите его над тонким слоем силиконовой смазки. Вырезать кусок ленты Kapton, достаточно большой, чтобы покрыть PMMA кусок размещены над резервуаром белка и придерживаться на чипе NOA по всем краям. Образец белка инкапсулирован в резервуаре и чип может быть использован для экспериментов кристаллизации.

Сначала подготовите около 500 микролитров раствора кристаллизации, смешивая соответствующие объемы буфера и выжидающие растворы. Введите раствор кристаллизации в точку диализного чипа через жидкие разъемы, либо вручную со шприцем, либо с помощью автоматизированной системы, управляемой давлением. После того, как жидкий канал заполнен раствором кристаллизации и нет воздуха в ловушке внутри, печать вход и выход порты чипа с Parafilm ленты.

Pipette соответствующий объем белкового раствора в белковом резервуаре и инкапсулировать образец белка, как уже было описано. Рост белкового кристалла можно визуализировать и записывают с помощью цифровой камеры. Для изготовления микрочипов диализа мы выбрали оптически прозрачные и биологически инертные материалы, демонстрируя высокую совместимость для экспериментов по рентгеновской дифракции на месте.

Оценивается фоновый шум, генерируемый материалами, состоящими из белкового отсека чипа, который находится на прямом пути рентгеновского луча. Белковый отсек состоит из регенерированную целлюлозную диализную мембрану, ленту Kapton и два слоя PMMA, один из них используется в качестве субстрата микрочипов, а другой используется для инкапсуляции образца белка. На этом снимке иллюстрируется фоновый шум, порожденный лентой Kapton, регенерированная целлюлозная диализная мембрана, слой PMMA и их сборка.

Несмотря на то, что фотосываемая смола NOA состоит из основного тела микрочипов, не входит в эти измерения, поскольку она не является частью белковой камеры. Диффузные кольца, приписываемые взаимодействию рентгеновских лучей с материалами, можно увидеть для ленты Kapton в разрешении ниже четырех ангстремов, PMMA от четырех до восьми ангстремов и диализной мембраны от четырех до пяти ангстремов. Общий фоновый шум, генерируемый чипом, в основном наблюдается при разрешении ниже шести ангстремов, что указывает на то, что обработка данных дифракции с высоким разрешением лизозима не влияет.

Микрочипы были установлены перед рентгеновским лучом с 3D печатной поддержкой, которую мы разработали для экспериментов по рентгеновской дифракции на месте, и он может в содержать до трех фишек одновременно. Эксперименты проводились для оценки эффективности микрочипов для кристаллизации модельно-растворимых белков методом микродиализа. Кристаллы лизозима были выращены на 293 кельвинах в двух разных условиях.

Первое состояние кристаллизации содержало 1,5 хлорида натрия натрия и 0,1 ацетата натрия. Второе состояние кристаллизации содержало один хлорид натрия моляра, 0,1 ацетата натрия натрия и 30% полиэтиленгликоль 400, и было выбрано, чтобы показать совместимость микрочипов и метода микродиализа, с осадками высокого молекулярного веса и вязкими растворами. Эксперименты по кристаллизации проводились в статических условиях.

После того, как кристаллы лизозима были выращены на микрочипе, они использовались для экспериментов по рентгеновской дифракции на месте при комнатной температуре. Микрочипы были установлены на линии луча с помощью 3D печатной поддержки и полные рентгеновские наборы данных дифракции были собраны из двух кристаллов лизозима. После обработки рентгеновских данных дифракции карта плотности электронов одного кристалла лизозима была получена в разрешении 1,95 ангстрема, как показано на рисунке A.Figure B, на карте плотности электронов, полученной при разрешении 1,85 ангстрема.

После слияния двух наборов данных, полученных из двух различных кристаллов лизозима, обе карты плотности электро показывают подробную структурную информацию, которая может быть получена с помощью экспериментов по дифракции на месте, проводимых непосредственно на микрочипах диализа при комнатной температуре, из одиночных или нескольких кристаллов белка. Мы продемонстрировали процедуру изготовления микрофлюидных устройств, предназначенных для кристаллизации белка на чипе методом микродиализа, а также эксперименты по дифракции на месте при комнатной температуре. Мы использовали производственные материалы с высокой рентгеновской прозрачностью, совместимые для кристаллографии белка in situ.

Сбор данных дифракции автоматизирован с использованием 3D печатной поддержки чипов, которые могут быть установлены непосредственно в макромолекулярных линиях кристаллического луча. Универсальность этого микрочипа проистекает из использования микродиализа для обратимого контроля условий кристаллизации и картовых фазовых диаграмм с использованием небольшого объема белка. Прототип устройства прост, что позволяет изготовить до 30 микрочипов в течение одного дня в чистой комнате, с относительно недорогими материалами.

Мы ожидаем, что эти особенности чипов могут быть использованы для серийных рентгеновских кристаллических исследований более сложных целей белка.