Контролируемое напряжение 3D-гидрогелей при визуализации живой микроскопии

Биологические ткани растут в трехмерной мягкой среде, через которую клетки подвергаются воздействию различных механических сигналов. Наш метод позволяет растягивать гидрогели трехмерным образом для исследования биомеханических реакций. Этот метод позволяет равномерно растягивать гидрогели по толщине при одновременном выполнении визуализации в реальном времени.

Кроме того, геометрией гидрогеля можно манипулировать до любого размера и формы. Знания о том, как клетки и внеклеточный матрикс реагируют на силы, важны для выявления того, как развиваются ткани и прогрессируют заболевания. Это может привести к потенциальному развитию методов лечения рака и моделей тканевой инженерии.

Начните с использования лазера или ручного резака, чтобы создать резиновую полоску с отверстием в центре. Вырежьте прямоугольник из гидрофобной пленки так, чтобы он был шире силиконовых полосок, и вымойте пластиковую посуду с 70% этанолом. После высыхания безворсовыми салфетками поместите герметизирующую пленку в форму и поместите одну силиконовую полоску со снятой с одной стороны полиэтиленовой пленкой в центр каждого куска герметизирующей пленки.

Для образования фибринового геля равномерно подайте 2,5 микролитра фибриногена с холодной маркировкой в силиконовый вырез каждой полоски так, чтобы вся окружность каждого выреза контактировала с фибриногеном, стараясь не допустить образования воздушных карманов или пузырьков где-либо в растворах. Сразу же добавьте 2,5 микролитра охлажденного тромбина непосредственно в каждый раствор фибриногена и быстро перемешайте растворы с помощью тщательного пипетирования, перемещая наконечник вокруг всей смеси для создания максимально однородного раствора. После смешивания поместите закрытую посуду в инкубатор на 30 минут для полимеризации гелем.

В конце инкубации добавьте в чашку достаточное количество PBS для погружения гелевых силиконовых конструкций и осторожно поднимайте каждый образец из чашки, следя за тем, чтобы слой герметизирующей пленки оставался прилипшим к полоске. Медленно отслаивая от одного конца силикона к другому, осторожно отсоедините герметизирующую пленку от каждого кусочка силикона, затем поместите полоску обратно в чашку и поместите чашку на столик светового микроскопа для оценки состояния образца. Чтобы загрузить образец на устройство для растяжения, наполните ванну PBS и поместите силиконовую полоску, содержащую гель для образца, на верхнюю часть ванны так, чтобы концы полоски находились по обе стороны ванны.

Поместите зажимы и тканевые полоски, а затем затяните так, чтобы все части были соединены в одну прямую полосу с вырезом в центре. Поместите материал в колодец и закрепите крышку на дне колодца, затем поместите алюминиевую жидкость в устройство для растяжения. Заполните лунку одним-двумя миллилитрами клеточной среды PBS и поместите в устройство гелевую конструкцию из полоски ткани.

Зажмите тканевую полоску в кронштейне так, чтобы вырез геля оказался в центре, прежде чем аккуратно поместить и зафиксировать штифтовую вставку на место в устройстве. Поместите и зафиксируйте другую тканевую сторону в шпинделе и поместите устройство для растяжения и прикрепленный образец на столик конфокального микроскопа. С помощью USB-кабеля подключите микроконтроллер к компьютеру и подключите серводвигатель к микроконтроллеру.

Затем откройте модуль управления устройством растяжения на компьютере, чтобы получить изображение образца. Чтобы определить, подходит ли образец для эксперимента, используйте визуализацию в реальном времени с низким разрешением, чтобы отсканировать весь гель и определить самую низкую Z-позицию, при которой видна полная адгезия к внутренним стенкам выреза без разрывов или пузырей. Отметив Z-расположение микроскопа, отсканируйте границу раздела флуоресцентной метки геля и силиконовой полоски, чтобы определить полную адгезию геля к силикону по всей его окружности.

После сканирования перемещайте предметный столик в направлении Z до тех пор, пока в геле больше не будет непрерывности, и обратите внимание на верхнюю границу положения Z. Затем вычтите верхнюю границу направления Z из нижнего предела, чтобы рассчитать толщину образца. Чтобы определить положение образца перед растяжением, нажмите «Перейти к нулевому сервоприводу POS» в программном обеспечении модуля, чтобы убедиться, что серводвигатель находится в нулевом положении, и прикрепите серводвигатель к устройству для вытягивания, соблюдая осторожность и не создавая нагрузки на образец.

Во время визуализации нажимайте кнопку «плюс один», чтобы перемещать мотор на один градус по часовой стрелке. Когда правая сторона выреза переместится, нажмите кнопку «минус один», чтобы перевернуть образец в предпоследнее положение, чтобы образец оставался под минимальным напряжением. Нажмите Set Min Servo Position, чтобы задать эталонное положение и получить изображение всей области геля с увеличением в 40 раз и высоким разрешением, сделанное по оси Z, в качестве базового образца для анализа постобработки.

Когда все изображения будут получены, перемещайте серводвигатель на один градус в секунду, пока не будет достигнута желаемая величина растяжения. При каждой величине растяжения, для которой требуется провести анализ, убедитесь, что гель не отделился от силикона ни в одной точке по всей его окружности, отсканировав границу раздела между гелем и силиконом, затем захватите набор изображений стека Z плитки с высоким разрешением всей области геля для анализа постобработки. Увеличение и ручное отслеживание агрегатов гранул во время растяжения геля позволяет рассчитать локальные деформации геля в осевом и перпендикулярном направлениях.

Как правило, осевые пряди распространяются относительно линейно от края силиконового выреза к центру геля и имеют больший размер, чем сжимающие перпендикулярные деформации. Здесь показаны изображения с большим увеличением типичного нерастянутого и относительно изотропного гидрогеля и водорода при высокой 80%-ной деформации выреза, изображающие высоковыровненные волокна в направлении растяжения. Анализ переориентации волокон выявил приблизительно линейную зависимость между выравниванием волокна и внешней деформацией на вырезе до деформаций 40% при умеренном насыщении при деформациях выше 40%.

Обратите внимание, что реакция геля на растяжение относительно равномерна по толщине Z. Как показано в этом предварительном конечно-элементном моделировании, выполненном на 2D-непрерывном материале, цветовой мат колеблется от 38 до 42%, что указывает на то, что деформации геля относительно однородны по всей круглой области геля. Важно убедиться, что гидрогель полностью прилегает к внутренним стенкам геометрического выреза, так как адгезия и непрерывность имеют решающее значение для надежного растяжения образцов.

Изменяя геометрию силиконового выреза, мы можем запрограммировать градиенты деформации и выравнивания волокон, поэтому при встраивании ячеек мы можем анализировать реакцию на эти градиенты.