Метаболическое профилирование для определения бактерицидных или бактериостатические эффекты новых натуральных продуктов с использованием изотермальной микрокалориметрии

Понимание способа действия новых антибактериальных соединений является важной, но трудной задачей. Этот метод дает представление о таких механизмах, и его легко реализовать. Этот метод позволяет в режиме реального времени наблюдения антибактериальных эффектов в неинвазивной манере позволяет дальнейшего анализа выборки.

Хотя практика с микробиологическими методами является необходимым условием, эксперимент легко выполнить. Принимая ваше время с анализом данных очень важно при выполнении микрокалориметрии в первый раз. Начните с использования спектрофотометра на длине волны 600 нанометров для измерения оптической плотности ночной культуры.

Разбавить культуру в 5 раз от 10 до 5-й колонии формирования единиц на миллилитр свежей средней концентрации MHB и добавить 150 микролитров клеток на каждую 1,5 миллилитровую трубку антибиотика в концентрации интереса. Затем смешайте соединение с клетками вихрем. Чтобы подготовить вставки, добавьте 120 микролитров каждой бактерии антибиотик смеси в отдельных пластиковых вставок в соответствующих скважин 48-хорошо пластины и использовать пинцет, чтобы поместить все титановые флаконы в держатели.

Аккуратно перенесите вставки в титановые флаконы в пластину держателя и свободно поместите титановые крышки на все флаконы. Когда все вставки были переданы, поместите держатель на назначенную область на выборочных станциях и используйте гаечный ключ, установленный на 40 сантиметрах, чтобы затянуть все крышки. В системном программном обеспечении, начать новый эксперимент и отказаться от образца вставки руку из инструмента.

Поместите подготовку на мост с колонкой восемь лицом к образцу вставки открытия и осторожно нажмите пододержатель чашки в инструмент в позиции один. Подождите 10 минут, пока система стабилизируется перед маркировкой экспериментальных скважин. Затем нажмите на руку вставки образца, пока пододержатель чашки находится на положении два.

После того, как система стабилизируется в течение 20 минут, нажмите на руку вставки образца, чтобы распоставить три и втягивать руку вставки образца, пока она не находится в бегущем положении. Выделите все скважины в программном обеспечении и выберите начало реакции, а затем запустите эксперимент до тех пор, пока тепловые выбросы не будут стабилизироваться на нуле. В конце анализа выберите стоп.

Программное обеспечение будет спросить, если вы уверены. Выберите да и сохраните эксперимент для анализа данных. Затем вставьте образец вставки руку полностью в инструмент и заниматься магниты для получения подсюха.

Для анализа данных откройте программное обеспечение и выберите открытый эксперимент. В всплывающем окне выберите интерес эксперимента и нажмите кнопку "Открыть". Нажмите выберите все и определите базовый уровень для нормализации данных в каждой позиции.

В всплывающем окне выберите период времени более 30 минут в фазе задержки. После выбора базовый уровень в термограмме появится зеленым цветом. Закройте окно базового раздела, затем нажмите сохранить и закрыть программное обеспечение.

Затем откройте веб-приложение для анализа калорий SymCel. Нажмите на просмотр, чтобы загрузить файл, представляющий интерес, и выберите эксперимент. Метаболические параметры будут автоматически рассчитаны для 32 образцов.

Чтобы соответствовать данным о тепловом потоке в модели Gompertz и/или Richards Growth, нажмите функцию роста. Модели роста будут отображаться в кумулятивном разделе для сравнения с необработанными данными в разделе потока. Чтобы загрузить рассчитанные параметры, щелкните меры загрузки, выберите местоположение файла и нажмите сохранить.

Файл будет экспортироваться в электронную таблицу для дальнейшего анализа. Здесь отображаются термограммы, полученные путем разоблачения A.baumannii DSM-30008 для ципрофлоксацина в серийном разбавлении. Концентрации от 0,005 до 0,1 микромолара имеют минимальное влияние на рост и обмен веществ A.baumannii.

Лечение клеток 0,5 микромоляного ципрофлоксацина, однако, приводит к значительному сдвигу в продолжительности фазы задержки и к снижению максимального теплового потока. Эти два изменения вместе влияют на время пика, в результате чего увеличение примерно на шесть часов. На этом рисунке кумулятивное высвоеданное тепло построено со временем с эффектом каждой концентрации, отраженной наклоном склона.

Количественная оценка наклона термограммы позволяет вычислить максимальную скорость обмена веществ A.baumannii при наличии ципрофлоксацина с сопутствующим снижением скорости обмена веществ, наблюдаемым в клетках, обработанных 0,5 микромоляным ципрофлоксацином. Лечение рифампицином имеет драматическое влияние на термограммы A.baumannii DSM-30008. Также наблюдается значительное снижение тепловых выбросов, коррелирующих со снижением метаболической активности.

Обратите внимание на увеличение времени до пика для всех проверенных концентраций и снижение скорости обмена веществ, вызванное уменьшением склона для всех концентраций, которые обычно приписывают бактерицидный эффект. Чтобы обеспечить оптимальные результаты, используйте обратную трубу и предотвратить дополнительную жидкость по бокам вставки при передаче образца, а также убедитесь, что крышки должным образом закрыты.