Горизонтальные гиппокампа ломтики мыши мозга

Этот протокол облегчает подготовку горизонтальных срезов мозга гиппокампа для их использования в различных научных приложениях. Эта техника сохраняет целостность всех волоконных путей гиппокампа в пределах одного среза полушария. Этот протокол срезов идеально подходит для оценки неврологических изменений, возникающих при патологиях головного мозга, развивающихся и проявляющихся в зубчатой извилине.

Наиболее важным аспектом этого протокола является поиск баланса между максимально быстрым выполнением и бережным обращением с тканями мозга. Чтобы приготовить один литр ACSF, медленно смешайте все твердые химикаты, как указано, в 800 миллилитрах воды при постоянном помешивании с помощью магнитной мешалки, а затем медленно капните в соответствующих объемах сульфат магния и хлорид кальция. Затем используйте осмометр давления пара для проверки осмолярности от 305 до 315 миллиосмолей и непрерывно пузырчатся раствор ACSF при комнатной температуре с карбогеном, чтобы установить pH от 7,3 до 7,4.

Чтобы приготовить 250 миллилитров раствора для срезов с высоким содержанием сахарозы, добавьте эти соединения к 25 миллилитрам предварительно нарезанного раствора, как указано в таблице, и убедитесь, что осмолярность составляет от 320 до 325 миллиосмоля. Затем пузырьки раствора для ломтиков с высоким содержанием сахарозы в течение 10-15 минут с карбогеном, чтобы установить pH от 7,3 до 7,4, и храните раствор с высоким содержанием сахарозы в течение 20-30 минут при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока он частично не замерзнет. Чтобы подготовить рабочее место для вскрытия, заполните восстановительную камеру карбогенированным раствором ACSF и поместите камеру в водяную баню с температурой 32 градуса Цельсия.

Установите вибратом на соответствующую программу резки и заполните держатель льдом, установите его на вибратом и прикрепите лезвие к кронштейну вибратома. С помощью шпателя измельчите и перемешайте частично замороженный раствор для ломтиков с высоким содержанием сахарозы до получения неоднородной жижи. Затем спузырите раствор с карбогеном и используйте раствор, чтобы увлажнить лист фильтровальной бумаги поверх охлажденной 90-миллиметровой чашки для культур и наполнить 35-миллиметровую чашку для культур льдом.

Чтобы извлечь мозг, используйте ножницы для вскрытия, чтобы разрезать кожу головы самца мыши в возрасте от двух до шести недель и открыть черепную кость вдоль сагиттального шва. Используйте изогнутые щипцы для удаления черепа до тех пор, пока не станет виден весь мозг, включая обонятельные луковицы, и используйте шпатель, чтобы осторожно вычерпать неповрежденную ткань мозга. Поместите мозг в 35-миллиметровую чашку для культивирования и с помощью пипетки Пастера, наполненной раствором среза с высоким содержанием сахарозы, аккуратно удалите любые волосы или частицы крови из ткани.

С помощью шпателя перенесите очищенный мозг на кусок пропитанной фильтрующей бумагой листа и лезвием разрежьте мозг в продольном направлении пополам. Поместите оба полушария на только что срезанную медиальную сторону и с помощью лезвия сделайте параллельный разрез на дорсальной вершине каждого полушария, чтобы удалить дорсальную область каждого участка мозга. Поместите оба полушария на только что вырезанную дорсальную сторону вентральной частью мозга вверх и нанесите каплю суперклея на пластину для образцов.

С помощью наконечника пипетки распределите клей на большой площади, чтобы вместить оба кусочка ткани, и коснитесь кусочка ремешка фильтровальной бумаги к брюшной стороне одного полушария. Используйте еще один ремешок из фильтровальной бумаги, чтобы осторожно наполовину высушить тыльную сторону мозга и расположите полушарие дорсальной стороной вниз на клее на пластине для образца. С помощью двух дополнительных лент фильтровальной бумаги расположите вторую полусферу на клее, как показано только что на рисунке, и поместите пластину с образцом в камеру для нарезки.

Затем быстро, но осторожно накройте тарелку ледяным высокосахарозным раствором слякоти. Чтобы получить участки мозговой ткани, расположите вибратомное лезвие перед медиальной стороной полушарий и поднимите вибратомный стол так, чтобы лезвие находилось на той же высоте, что и вентральные стороны полушарий, которые теперь обращены вверх. С помощью вибратомного регулятора опустите лезвие на 600 мкм дальше в дорсальном направлении и разрежьте ткань до тех пор, пока первые два среза полностью не отделятся от двух полушарий.

Когда первые два среза ткани будут получены, измените направление резки и опустите лезвие еще на 300 микрон, прежде чем снова нарезать. Когда гиппокамп станет видимым, с помощью расширенной пластиковой пипетки Пастера соберите и перенесите срезы в камеру восстановления на водяной бане. Оставьте срезы в заполненной ACSF восстановительной камере на один час, затем поместите восстановительную камеру при комнатной температуре на 30 минут перед выполнением электрофизиологической записи образцов тканей.

Здесь можно наблюдать репрезентативные записи отрицательного и положительного поля возбуждающих постсинаптических потенциалов из срезов низкого и высокого качества соответственно. В отрицательном примере след демонстрирует большую амплитуду залпа волокон при деполяризации стимулированных нейронных волокон, которая даже выше, чем фактическая амплитуда fEPSP, в то время как высококачественный след демонстрирует небольшое отношение залпа волокон к fEPSP и высокую амплитуду fEPSP. Жизнеспособность среза мозга также может быть проанализирована путем построения графика возбуждающих постсинаптических потенциальных наклонов поля в зависимости от амплитуд волчка волокон.

Кривые ввода/вывода, которые обычно используются для определения качества среза, могут быть получены путем приложения увеличивающихся импульсов тока к срезу мозга и мониторинга последующих реакций fEPSP. Из-за неоптимальных проводимости плохо сохранившейся мозговой ткани низкокачественные срезы мозга демонстрируют сниженные кривые входа/вывода. Жизнеспособные срезы мозга имеют стабильные синаптические базовые линии передачи, в то время как срезы мозга с нестабильной базой не могут быть использованы для дальнейших протоколов обусловливания для изучения синаптической пластичности мозговых цепей.

Базовые записи fEPSP также могут быть полезны для мониторинга влияния лекарств на саму синаптическую передачу. Кроме того, срезы мозга могут быть использованы в сочетании с индикатором кальция для получения записей флуоресцентной визуализации и для изучения притока кальция при различных условиях среза или лечении. Убедитесь, что вскрытие мозга выполнено не более чем через 1,5 минуты после жертвоприношения, и это по-прежнему является гарантией того, что мозговая ткань останется без охлаждения и подачи кислорода лишь на короткое время.

Срезы мозга гиппокампа имеют множество различных применений — от молекулярно-биологических методов до электрофизиологии. Эта процедура способствует интенсивному исследованию анатомии гиппокампа и неврологических процессов.