Высокопроизводительное клеточное профилирование целевых соединений деградации белка с использованием клеточных линий HiBiT CRISPR

Такой подход позволяет осуществлять клеточный мониторинг деградации белка и проводить быстрый скрининг соединений-деградеров. Динамика деградации может быть отслежена в клеточном контексте высокочувствительным и количественным образом, что позволяет точно определить ключевые параметры деградации. Эти методы позволяют проводить HTS-профилирование активности соединений деградера, что позволяет проводить сортировку на ранней стадии терапевтического открытия.

Они также дают представление всем, кто хочет изучить модуляцию эндогенных целевых уровней, будь то повышение или уменьшение. Демонстрировать процедуру будет Селия Бисбах, научный сотрудник моей лаборатории. Начните с подготовки и гальванизации адгезивных или суспензионных клеток млекопитающих.

Отрегулируйте плотность ячеек в соотношении от 2,22 умножить на 10 до 5-х ячеек на миллилитр и распределить их по тарелкам с минимум тремя лунками на экспериментальное и контрольное состояние. Приготовьте серийно разбавленные PROTAC, или испытательные планшеты для разлагающего состава, в 1000-кратной концентрации в 100% ДМСО. Затем разбавьте его до 10-кратной конечной концентрации в среде клеточной культуры.

Добавьте равное количество ДМСО в среду, чтобы создать бескомпонентный контроль ДМСО. Добавьте соответствующее количество 10-кратного соединения или контрольного раствора в клетки планшета и инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе. Чтобы измерить люминесцентный сигнал в конечной точке, приготовьте реагент для обнаружения литических веществ в 2 раза, добавив 20 микролитров литической подложки и 10 микролитров белка LgBiT на каждый миллилитр литического буфера.

Подготовьте достаточное количество реагента для всех анализируемых лунок, включая дополнительный объем для компенсации ошибки пипетирования. Добавьте приготовленный реагент для детектирования литических веществ в ячейки и перемешайте планшет на микропланшетном вихревом смесителе в течение 10-20 минут при 350 об/мин. Измерьте люминесценцию на люминометре, способном считывать показания 96 или 384 луночного планшета.

За 30-40 минут до измерения желаемой конечной точки приготовьте 6-кратный раствор реагента для определения жизнеспособности клеток, добавив 10 микролитров субстрата к двум миллилитрам буфера для анализа. Приготовленный реагент добавить в лунки и кратко перемешать на микропланшетном вихревом миксере.

Затем инкубируйте планшет в течение 30 минут в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия. В нужной конечной точке измерьте флуоресценцию на приборе, способном считывать флуоресценцию в формате 96 или 384 лунок. Приготовьте 2x литический реагент, как описано ранее.

Затем добавьте реагент в лунки и перемешайте пластину на микропланшетном вихревом миксере в течение 10 – 20 минут. После смешивания используйте люминометр для измерения люминесценции. Для демонстрации анализа литической деградации с одной концентрацией несколько белков-мишеней CDK были эндогенно помечены HiBiT и обработаны PROTAC TL12-186 на основе панкиназы цереблона.

Уровень белка CDK измеряли в разные моменты времени, и определяли фракционный RLU. Чтобы понять, как белки CDK напрямую сравниваются друг с другом с точки зрения потери белка, фракционные RLU были рассчитаны как общий процент деградации. Анализ кинетической деградации проводили путем эндогенного мечения белков-членов семейства BET клетками HiBiT и HEK293, стабильно экспрессирующими белок LgBiT.

Затем клетки обрабатывали тремя различными концентрациями pan-BET PROTACs. dBET6 на основе цереблона и ARV-771 на основе VHL. Здесь показаны профили деградации кинетической дозовой реакции клеток Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat, стабильно экспрессирующих белок LgBiT, обработанных четырьмя различными молекулярными соединениями клея.

Наблюдаются значительные различия в реакции на деградацию между соединениями, а также между рядами концентраций. Для количественной оценки деградации и рангового порядка соединений были использованы профили реакции доза для расчета ключевых параметров деградации, включая скорость деградации, максимум деградации и значения Dmax50. Мультиплексный анализ жизнеспособности клеток не показал потери жизнеспособности клеток в тестируемых концентрациях.

Наиболее важными шагами в этом протоколе являются определение дробного RLU или процентной деградации путем нормализации по контролю ДМСО. Следуя этому протоколу, можно провести фенотипический анализ, чтобы понять, как потеря определенного белка может повлиять на здоровье или функцию клеток. Кроме того, эти клеточные линии HiBiT также могут быть использованы для изучения белковых взаимодействий или связывания малых молекул с помощью технологии NanoBRET.