Анализ иммунного репертуара рецепторов Т- и В-клеток с использованием секвенирования следующего поколения
12 января 2021 г.
Текущий протокол описывает метод выделения ДНК из образцов крови и биопсии кишечника, генерацию библиотек TCRβ и IGH PCR для секвенирования следующего поколения, производительность запуска NGS и анализ основных данных.
Этот метод позволяет исследовать специфические Т- и В-клетки на нуклеотидном или аминокислотном уровне и, таким образом, может идентифицировать динамические изменения в популяциях лимфоцитов и параметры разнообразия при различных расстройствах. Преимуществом секвенирования следующего поколения является возможность идентифицировать уникальные клоны Т- или В-клеток и отслеживать их в разных анатомических местах или у разных людей. Это имеет потенциал для идентификации новых биомаркеров при различных заболеваниях.
Продемонстрировать эту процедуру будет Наоми Саламон, научный сотрудник из моей лаборатории. Начните с выполнения пищеварения и лизиса клеток биопсии кишечника. Извлеките биопсию кишечника либо свежесбранной, либо хранящейся при отрицательных 20 или отрицательных 80 градусах Цельсия.
Если вы используете замороженные биопсии, разморозьте их на льду. Добавьте 600 микролитров раствора лизиса ядер в стерильную 1,7-миллилитровую микроцентрифужную трубку, охлажденный на льду. Затем поместите биопсию в трубку и инкубируют ее при 65 градусах Цельсия в течение 15-30 минут.
Добавьте 17,5 микролитров 20-миллиграммов на миллилитр протеиназы К и инкубируют трубку в течение ночи при 55 градусах Цельсия с легким встряхиванием. После инкубации дайте образцу остыть до комнатной температуры в течение пяти минут. Для выделения ДНК из крови осторожно раскачивайте трубку, пока она не будет тщательно перемешана.
Затем переложите кровь в стерильную 15-миллилитровую центрифужную трубку, содержащую девять миллилитров раствора лизиса клеток. Инвертировать трубку несколько раз в течение 10-минутного инкубационного периода при комнатной температуре. Центрифуга при 600г в течение 10 минут при комнатной температуре.
Затем выбросьте как можно больше супернатанта, не нарушая видимую белую гранулу. Вихряйте трубку энергично в течение 15 секунд до полного повторного суспендирований. Добавьте три миллилитра раствора лизиса ядер и пипетку несколько раз, в результате чего раствор станет вязким.
Добавьте буфер осаждения белка в образец. Затем энергично вихрь в течение 20 секунд, и высиживая его на льду в течение пяти минут. Центрифугу по 16 000 г в течение четырех минут с образованием плотной гранулы, содержащей осажденные белки.
Осторожно перенесите супернатант, не нарушая гранулу, в новую 1,7-миллилитровую трубку. Добавьте один миллилитр 2-пропанола в пробирку, содержащую супернатант, и осторожно перемешайте его путем инвертирования. ДНК должна стать видимой как белое плавающее вещество.
Центрифугу по 16 000 раз г в течение одной минуты и удалите супернатант полностью. Добавьте один миллилитр свежеприготовленного 70%-го этанола и несколько раз переверняйте пробирку. Центрифугировать его при 16 000 г в течение одной минуты при комнатной температуре.
Затем осторожно выбросьте супернатант. Повторите промывку этанолом. Затем оставьте гранулу ДНК сушиться на воздухе в течение 10-15 минут.
Добавьте 50 микролитров сверхчистой воды в ДНК и выполните количественную оценку ДНК, как описано в текстовой рукописи. Используйте 150 нанограммов ДНК, чтобы подготовить библиотеку к секвенированию. Поместите пипетки и наконечники в капюшон с ультрафиолетовым светом на 15 минут, чтобы разрушить остаточную ДНК.
Между тем, позвольте различным индексным пробиркам и ДНК-полимеразе оттаивать на льду. В биологической вытяжке добавьте 45 микролитров из различных индексных пробирок в трубки ПЦР, заботясь о том, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Затем добавляют 0,2 микролитра ДНК-полимеразы и пять микролитров подготовленной ДНК в трубки ПЦР.
Запустите ПЦР с помощью предустановленной программы в соответствии с инструкциями производителя. Используйте магнитные шарики для удаления излишков праймеров, нуклеотидов и ферментов. Прогрейте бусины до комнатной температуры не менее 30 минут и приготовьте достаточно свежего 80%-ного этанола на 400 микролитров на образец.
Добавьте шарики в каждую трубку ПЦР и перемешайте, пипетировка 10 раз. Инкубировать тубы в течение 10 минут при комнатной температуре. Поместите смешанный образец на магнитную подставку на пять минут.
Затем аспирировать прозрачную жидкость и выбросить. Аспирировать оставшуюся жидкость с помощью 10-микролитрового наконечника. Добавьте 200 микролитров 80% этанола в каждый образец и инкубировать в течение 30 секунд.
Аспирировать 195 микролитров этанола и выбросить. Затем аспирировать оставшуюся жидкость с помощью 10-микролитрового наконечника. Повторите промывку этанолом.
Затем откройте колпачки трубок и дайте им высохнуть на воздухе в течение пяти минут. Через пять минут извлеките образцы из магнитного стенда и добавьте 25 микролитров буфера элюирования. Перемешать путем пипетки до однородности и инкубировать при комнатной температуре в течение двух минут.
Поместите трубки на магнитную подставку на пять минут. Затем переложите 22 микролитра в новую ПЦР-трубку и измерьте концентрацию ДНК. Количественно оценить ампликон, как описано в тексте рукописи.
После расчета конечной концентрации ДНК и размера в парах оснований пика продукта, подготовьте новую смесь разбавления для каждого образца и перенесите два микролитра ее в новую смесь для бассейна. Приготовьте свежий раствор 0,2 нормального гидроксида натрия и добавьте в разбавленный библиотеку 10 микролитров. Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы детазать двухцепочечную ДНК.
Затем добавьте 980 микролитров предварительно охлажденного буфера из набора в трубку, содержащую ДНК, и кратковременно вихрь. Загрузите 600 микролитров конечной библиотеки на назначенный картридж и поместите образцы в машину. Чтобы выполнить анализ последовательности, загрузите метрики виртуализации из секвенсора и убедитесь, что данные находятся в соответствующих диапазонах.
Повторите запуск для образцов, которые не соответствуют критериям. Этот протокол был использован для выполнения базового анализа репрезентативных аутологических образцов крови и ректальной части пациента с дефицитом рецептора IL10 и историей тяжелого инфантильного начала ВЗК. Сэмплы были проанализированы как для репертуара TCR-beta, так и для репертуара IGH.
Все клоны могут быть идентифицированы по их уникальной последовательности на нуклеотидном или аминокислотном уровне. Эти последовательности можно сравнивать между разными пациентами в поисках общих клонов или у одного и того же пациента между разными анатомическими участками. Пять наиболее часто встречаемых клонов для каждого примера показаны здесь.
Изображения TreeMap были сгенерированы для широкого обзора репертуара. Каждый цветной квадрат представляет собой свой клон, а размер коррелирует с его частотой. Эти изображения TreeMap демонстрируют клональное расширение в репертуаре IGH кишечника.
Напротив, в репертуаре TCR-beta в крови наблюдается выраженное клональное расширение по сравнению с аутологичной кишками. На генном уровне NGS предоставляет информацию об использовании V, D и J на уровне гена, семейства или аллеля. Кроме того, конкретные комбинации VDJ могут быть выведены из данных для репертуаров TCR-beta и IGH, выявляя дифференциальные модели использования генов в различных условиях.
Этот протокол может быть применен как к ДНК, так и к РНК и может быть использован для генерации репертуаров TCR-альфа, TCR-гамма и IGL. Он также совместим с другими органами после незначительных изменений пищеварения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод выделения ДНК из образцов крови и биоптатов кишечника, создания ПЦР-библиотек TCRβ и IGH для секвенирования следующего поколения (NGS), а также проведения базового анализа данных. Этот метод позволяет изучать динамику T- и B-клеток на нуклеотидном или аминокислотном уровне, что способствует идентификации уникальных клонов в различных анатомических областях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Геномика
- Секвенирование следующего поколения
Теоретическая часть
- Секвенирование следующего поколения позволяет проводить детальный анализ популяций лимфоцитов.
- Этот метод может выявить динамические изменения иммунных ответов при различных заболеваниях.
- Идентификация уникальных клонов T- или B-клеток может привести к открытию новых биомаркеров.
- Процедура демонстрируется лаборантом-исследователем в лаборатории.
Цель исследования
- Для выделения ДНК из биологических образцов для секвенирования.
- Для анализа разнообразия Т- и B-клеток при различных заболеваниях.
- Для отслеживания клонов иммунных клеток в различных анатомических локализациях.
Используемые методы
- Выделение ДНК из крови и биоптатов кишечника.
- Создание ПЦР-библиотек TCR и IGH.
- Проведение секвенирования следующего поколения (NGS).
- Базовый анализ данных результатов секвенирования.
Основные результаты
- Успешное выделение ДНК из образцов.
- Создание библиотек, подходящих для NGS.
- Идентификация уникальных клонов T- и B-лимфоцитов.
- Получение данных о разнообразии лимфоцитов при различных заболеваниях.
Выводы
- Данный метод расширяет понимание иммунной динамики.
- Он создает основу для идентификации биомаркеров при различных заболеваниях.
- Этот подход может быть адаптирован для различных исследовательских целей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Анализ иммунного репертуара Т- и В-клеточных рецепторов с помощью секвенирования следующего поколения (NGS) предоставляет биофармацевтическим исследованиям и разработкам детальное представление о динамике адаптивного иммунитета, что позволяет снизить механистические риски при валидации мишеней и поиске биомаркеров. Путем количественного определения клональности, использования генов и разнообразия репертуара при различных патологических состояниях данный метод повышает прогностическую уверенность на ранних этапах поиска и при принятии трансляционных решений. Эта возможность напрямую применима в иммунологических разработках, целью которых является установление связи между иммунными ответами и терапевтическими результатами при воспалительных, инфекционных, онкологических и аутоиммунных заболеваниях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем отслеживания антигенспецифичных клонов T- и B-лимфоцитов в различных анатомических зонах и временных точках.
- Операционная ценность: обеспечивает разрешение иммунных репертуаров на уровне нуклеотидов или аминокислот для уточнения функционального взаимодействия с мишенью и снижения биологических рисков.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля препаратов за счет выявления клонально экспансированных популяций, которые коррелируют с фенотипом заболевания или ответом на лечение.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать стандартизированные количественные профили иммунного репертуара, подходящие для стандартизации анализа и оценки воспроизводимости.
- Операционная ценность: Обеспечивает подготовку валидированных биологических систем из крови и тканей для последующих рабочих процессов скрининга.
- Техническая ценность: Позволяет получать показатели клональности и разнообразия, которые служат надежными результатами для кампаний по скринингу химических соединений или биопрепаратов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации путем отслеживания клональной динамики в системах, релевантных заболеванию.
- Сопоставление биомаркеров: облегчает идентификацию общих или расширенных клонов у разных пациентов, что способствует поиску трансляционных биомаркеров при иммуноопосредованных расстройствах.
- Продвижение с учетом рисков: позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), выявляя различия в использовании VDJ-генов и паттерны клональной экспансии, связанные с патофизиологией.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в непрерывный процесс разработки — от ранней валидации мишени до идентификации ведущих соединений и доклинических исследований, что особенно важно для направлений иммунологии и иммуноонкологии, где критически необходима минимизация рисков, связанных с иммунными механизмами.
- Фундаментальная биология: поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей, выявляя антиген-зависимый клональный отбор и экспансию в популяциях T- и B-клеток.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированной подготовки библиотек и секвенирования репертуаров TCR и IGH из выделенной ДНК.
- Аналитика: предоставляет количественные данные, включая клональность, использование семейств генов (V, D, J) и отслеживание уникальных клонов для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническим этапом, позволяя осуществлять лонгитюдное отслеживание иммунных клонов в крови и тканях.
- Корпоративное использование: функционирует как многократно используемая технологическая платформа, применимая к различным областям заболеваний и типам образцов после адаптации протокола.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней, опосредованных иммунным ответом, за счет прямого измерения динамики репертуара.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря контролируемым рабочим процессам изоляции ДНК, подготовки библиотек и NGS.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах выявлять иммунологически активные клоны, что снижает биологические риски на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков путем установления связи между изменениями иммунного репертуара, механизмами заболевания и терапевтическим воздействием.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области иммуногеномики, подготовки библиотек для NGS и биоинформатического анализа данных иммунного репертуара.
- Зависит от наличия доступа к секвенаторам NGS, системам очистки на основе магнитных частиц и контролируемых лабораторных условий для работы с ДНК.
- Необходима межкомандная стандартизация между подразделениями иммунологии, геномики и анализа данных для обеспечения согласованности анализа репертуара.
- Требуется адаптация протоколов переваривания тканей для органов, отличных от кишечника, при сохранении выхода и целостности ДНК.
- Практические ограничения включают требования к количеству исходной ДНК и возможную систематическую ошибку, возникающую при ПЦР-амплификации во время подготовки библиотек.
