Культивирование трехмерного реконструированного эпидермиса человека в больших масштабах

Модель эпидермиса человека in vitro или сконструированная модель эпидермиса человека были впервые разработаны в девяностых годах с основной целью разработки альтернативных методов тестирования экспериментов на животных. Эти 3D-модели эпидермия в настоящее время широко используются для проверки безопасности и эффективности косметических ингредиентов. В то время как его можно приобрести у нескольких поставщиков тканей, возможность воссоздать 3D-модель в лаборатории дает большую гибкость в конечной точке интереса.

Существует несколько исследовательских статей, кратко описывающих протокол восстановления 3D-эпидермальной модели, но на сегодняшний день не было доступных видео, показывающих критические этапы процесса восстановления. Это является причиной публикации этой видеобумаго. Приготовление реконструированного эпидермиса человека обеспечивает большую свободу в процессе культивирования, например, изменения в составе культуральной среды, провоспалительные или окислительные триггеры стресса, заглушение генов, представляющих интерес, а также ингибирование или стимуляция определенных биологических процессов.

Для начала разморозьте флакон с 1 миллионом крио-сохраненных нормальных эпидермальных кератиноцитов человека, или NHEKs, на водяной бане при 37 градусах Цельсия, погрузив часть флакона в воду. Высиживайте флакон в течение одной-двух минут на водяной бане, пока не будет виден только небольшой кусочек льда. Повторно суспендировать клетки очень осторожно, пипетируя вверх и вниз два-три раза.

Переложите клеточную суспензию в две колбы T75, содержащие в общей сложности 15 миллилитров предварительно предупрежденной оттаивающей среды, в результате чего плотность посева составит от 6,7 раз 10 до четвертой ячейки на сантиметр в квадрате. Предварительно заполните 24 луночника 1,5 миллилитрами погруженной среды, в идеале используя дозаторную пипетку. После культивирования клеток до 80% слияния они готовы к посеву во вставки для культивирования реконструированного эпидермиса человека, или RHEs.

Удалите базальную среду из колб T75 с помощью NHEKs. Промыть клетки, добавив пять миллилитров предварительно нагретого PBS в каждую колбу T75, затем удалите PBS из колб. Добавьте два-три миллилитра предварительно подогретого 0,05% трипсина-ЭДТА в каждую колбу, убедившись, что раствор трипсина равномерно распределен по площади клеточной культуры колбы.

Поместите колбы в инкубатор клеточной культуры на четыре минуты, затем проверьте, отсоеживаются ли клетки с помощью микроскопа при увеличении 10 X. Стук по колбе, чтобы помочь клеткам освободиться от поверхности колбы. Как только все клетки будут отделены, добавьте равный объем предварительно нагретого ингибитора трипсина в каждую колбу T75 и перенесите клеточную суспензию из колбы в трубку центрифуги.

Промыть колбы пятью миллилитрами предварительно разогретого ПБС и перенести в центрифужную трубку, содержащую клеточную суспензию. Центрифугировать собранные клетки в 400 раз G в течение пяти минут. Осторожно выбросьте большую часть супернатанта, оставив примерно от 100 до 200 микролитров в трубке.

Осторожно проведите пальцами по трубке, чтобы осторожно ослабить гранулу. Осторожно повторно суспендируйте гранулы клеток в небольшом объеме погруженной среды, пипетируя вверх и вниз от 5 до 10 раз, чтобы обеспечить однородную суспензию клеток. Начните с небольшого объема, чтобы избежать образования клеточных агрегатов, и добавьте до одного миллилитра погруженной среды на начальную колбу T75.

Подсчитайте ячейки в суспензии с помощью метода исключения синего цвета trypan. Разбавляют клеточную суспензию дополнительной погруженной средой до достижения концентрации от 3,525 раз 10 до пятой ячейки на миллилитр, используя первое уравнение, приведенное в текстовой рукописи. Выполните второй подсчет клеток разбавленного раствора и используйте второе уравнение в текстовой рукописи для расчета объема клеточной суспензии, который будет засеян во вкладыш культуры.

Повесьте 24 вставки для посева скважин в самое высокое положение несущей пластины и перенесите несущую пластину на 24 скважинные пластины, предварительно заполненные погруженной средой. Добавьте определенный объем клеточной суспензии к каждой вставке, заботясь о том, чтобы не коснуться вставки. После посева инкубируют 24 плиты колодца в течение 10-15 минут при комнатной температуре, чтобы преодолеть эффект края.

Не перемещайте пластины в течение этого времени. Переложите пластинки в инкубатор клеточной культуры, и оставьте их в погруженном состоянии на три дня. После трехдневной инкубации в инкубаторе клеточной культуры подвергают клетки, которые прилипли к поверхности мембраны, интерфейсу воздушной жидкости, или ALI, путем удаления погруженной среды из апикальной камеры с помощью аспирационной системы и стеклянной пипетки Пастера.

Заполните новые 24 скважинные пластины 1,5 миллилитрами свежей предварительно нагретой среды ALI и переложите несущую пластину с культурными вставками на новые многоствольные пластины. Перенесите многобойные пластины обратно в инкубатор клеточных культур. Обновляйте носитель ALI каждые два-три дня в течение 14 дней.

Кератиноциты в 2D культуре демонстрируют традиционную морфологию с последовательной полигональной формой. Через 15 дней в ALI реконструированный эпидермис человека образует полностью стратифицированную ткань, на которую указывают его четыре основных эпидермальных слоя. Ультраструктурный анализ реконструированного эпидермиса человека в разные моменты времени в протоколе восстановления выявляет процесс рогового ороговения с увеличением количества слоев участка роговицы с течением времени.

Кератиноциты в эпидермисе показывают различные профили экспрессии белка в зависимости от стадии их дифференцировки. Экспрессия инволюкрина проявляется преимущественно в слое SG, тогда как экспрессия филаггрина и лорикрина расположена в верхних слоях. Экспрессия кератина-10 была обнаружена во всех жизнеспособных слоях, за исключением слоя SB.

Реконструированный эпидермис человека демонстрирует функциональные десмосомные соединения, о чем свидетельствует экспрессия Десмоглейна-1 в межклеточном пространстве жизнеспособных эпидермальных слоев. Барьерные свойства реконструированной модели эпидермиса были исследованы путем оценки жизнеспособности ткани при местном лечении известным разрушителем барьера и путем оценки целостности ткани. Целостность ткани определяли через 15 дней путем измерения TEER вольтметром.

Исследована реакция эпидермиса на липополисахарид и фактор некроза опухоли альфа. Как ЛПС, так и альфа-обработка TNF были нетоксичными. относительно управления Triton X-100.

Высвобождение интерлейкина-1 альфа и интерлейкина-8 в среде RHE количественно оценивали с помощью лизиса IL. Лечение ЛПС привело к статистически значимому увеличению регуляции высвобождения интерлейкина-1 альфа и интерлейкина-8. Альфа-лечение ФНО привело к статистически значимому увеличению регуляции только высвобождения интерлейкина-1 альфа.

Однако явная тенденция повышения уровня интерлейкина-8 наблюдалась и при стимуляции ФНО альфа. Следуя этому протоколу, TEER может быть измерен как значение целостности барьера. Жизнеспособность или цитотоксичность могут быть измерены, например, с помощью анализа MTT или LDH.

Супернатант может быть использован для измерения секреции цитокинов или других белков. Кроме того, ткань может быть использована для изучения экспрессии белков или генов, представляющих интерес.