Поляризация клеток M1 и M2 человека моноцитов и анализ с цитометрией потока при микобактериальной туберкулезной инфекции

Этот протокол дает возможность проследить иммунную поляризацию клеток, полученных из моноцитов человека, на основе визуализации и глубокой характеристики зеленого флуоресцентного белка Mtb в различных субпопуляциях макрофагов с использованием 10-цветной проточной цитометрии. Это представляет собой эффективный и воспроизводимый метод изучения ответов на инфекцию Mtb в поляризованных макрофагах M1 или M2, включая оценку фенотипа и функции до и после инфекции. Чтобы изолировать PBMC от донорских оболочков человека, с помощью пипетки медленно наложите 15 миллилитров крови охристого покрытия на стенку 50-миллилитровой пробирки на 15 миллилитров среды с градиентом плотности и разделите клетки центрифугированием.

С помощью стерильной пипетки Пастера удалите верхний слой плазмы и осторожно перенесите слой мононуклеарных клеток в новую 50-миллилитровую пробирку. Добавьте в клетки бессывороточную среду RPMI до конечного объема 50 миллилитров и осторожно переверните пробирку несколько раз перед центрифугированием. Затем ресуспендируйте клетки в 20 миллилитрах бессывороточной среды для подсчета.

Чтобы инициировать дифференцировку макрофагов, разведите клетки до 5 умно-10-6-х клеток на миллилитр бессывороточной среды и засейте два миллилитра клеток в отдельные лунки шестилуночного планшета. Поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на два-три часа, чтобы клетки могли прилипнуть к дну лунки. В конце инкубации промыть лунки три раза одним миллилитром бессывороточной среды на одну промывку и добавить два миллилитра полной среды RPMI с добавлением 50 нанограммов на миллилитр GM-CSF или 50 нанограммов на миллилитр M-CSF для дифференцировки M1 или M2 соответственно в каждую лунку адгезивных клеток.

Через три дня после начала поляризации осторожно замените один миллилитр надосадочной жидкости из каждой лунки на один миллилитр свежей полной среды, дополненной соответствующими факторами роста. На шестой день культивирования добавьте 50 нанограмм на миллилитр интерферона гамма и 10 нанограммов на миллилитр ЛПС в лунки, обработанные GM-CSF, и 20 нанограммов на миллилитр IL-4 в лунки, обработанные M-CSF. Регулярно проверяйте морфологию клеточных культур, полученных из моноцитов, с помощью световой микроскопии, чтобы убедиться, что более мелкие моноциты дифференцируются в более крупные макрофагоподобные клетки.

Чтобы создать культуру туберкулезного белка в помещении уровня биобезопасности III, смешайте одну миллилитровую аликвоту размороженной суспензии бактерий с девятью миллилитрами полной среды TB в 50-миллилитровой пробирке с фильтрованной крышкой для 24-часовой инкубации в пробирке в инкубаторе для клеточных культур. На следующий день соберите бактерии центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в 15-20 миллилитрах свежей полной среды TB в новой 50-миллилитровой фильтрованной пробирке для культивирования колпачков, прежде чем вернуть бактерии в инкубатор для клеточных культур. После 7-10 дней культивирования промойте бактерии два раза в 35-40 миллилитрах стерильного буфера для мытья за одну стирку, повторно суспендируя бактерии в одном миллилитре бессывороточной среды RPMI после второго мытья.

Добавьте к бактериям еще девять миллилитров бессывороточной среды RPMI и обработайте бактерии ультразвуком в ультразвуковой аппарате на водяной бане в шкафу биобезопасности класса II в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем измерьте оптическую плотность одного миллилитра бактериальной суспензии на длине волны 600 нанометров в спектрофотометре, размещенном внутри шкафа биобезопасности. Чтобы инфицировать клетки, полученные из моноцитов, разбавьте бактерии в соотношении 5 умно-10 до 6-й колониеобразующей единицы на миллилитр в бессывороточной среде и замените надосадочную жидкость в каждой лунке шестилуночного клеточного культиватора одним миллилитром свежей среды, не содержащей сыворотки, и одним миллилитром бактериальной суспензии на лунку, чтобы получить кратность инфекции, равную пяти.

После четырехчасовой инкубации в инкубаторе для клеточных культур промывайте каждую лунку три раза одним миллилитром стерильного буфера для промывки за одну промывку, осторожно наклоняя планшет, чтобы удалить весь объем буфера с углов лунок после каждой промывки. Затем ресуспендируют инфицированные Mtb моноцитарные клетки в двух миллилитрах полной среды без антибиотиков. Чтобы окрашивать клетки для проточной цитометрии, инкубируйте инфицированные клетки с одним миллилитром буфера FACS с добавлением 0,5 миллимоляра ЭДТА на лунку в течение не менее 30 минут.

В конце инкубации соберите отделенные клетки с помощью щадящего пипетирования и перенесите их в отдельные микроцентрифужные пробирки с винтовыми крышками для центрифугирования. Ресуспендируйте клетки примерно в 50 микролитрах фторконъюгированного коктейля античеловеческих антител и представляющего интерес красителя для жизнеспособности и инкубируйте клетки в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, защищенных от света. После промывания зафиксируйте ячейки 200 микролитрами свежеприготовленного фиксирующего буфера на 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света.

После фиксации и промывки ресуспендируйте клетки в 400 микролитрах буфера FACS и переведите клетки в микроцентрифужные пробирки объемом один миллилитр. Чтобы проанализировать клетки, используйте компенсационные шарики для компенсации флуоресцентного сигнала для каждого флюорохром-конъюгированного антитела в коктейле и используйте неокрашенные клетки для установки ворот для популяции отрицательных клеток. Затем приобретите минимум 50 000 клеток на образец.

Как M1, так и M2 моноцитарные клетки демонстрируют вертикальный сдвиг в сторону более высокой зернистости и уменьшения размера клеток при инфицировании Mtb. Усиленная гибель клеток также наблюдается в инфицированных Mtb клетках M1 и M2 при кратности инфекции в пять по сравнению с неинфицированными клетками M0. Следует отметить, что значительно более высокая экспрессия Mtb GFP наблюдается в клетках M2 после четырех часов инфекции по сравнению с клетками M1.

Неинфицированные клетки M1 и M2 могут характеризоваться их рецептором CD64 и CD86 или CD200 и коэкспрессией CD163 соответственно. После четырех часов заражения Mtb в Mtb-позитивных М1-клетках наблюдается повышенная частота CD200-рецептор-положительных клеток, в то время как экспрессия CD163 снижается в М2-клетках. Бактерии Mtb GFP также могут наблюдаться в CD64-положительных М1-клетках и CD163-положительных М2-клетках с помощью конфокальной микроскопии.

Анализ UMAP показывает, что четырех часов инфекции Mtb недостаточно для того, чтобы повлиять на поляризацию макрофагов, в то время как 24 часа инфекции приводят к образованию четко разделенных кластеров неинфицированных и инфицированных клеток M1 и M2, которые экспрессируют различные профили экспрессии поверхностных маркеров. Кроме того, анализ PhenoGraph показывает, что 24 различных кластера разных размеров однозначно распределены среди неинфицированных и инфицированных Mtb клеток M1 и M2. Эффективность поляризации М1 или М2 или инфекционности Mtb может существенно варьироваться у разных доноров.

И поэтому рекомендуется включать в каждый эксперимент не менее двух доноров для уменьшения экспериментальных вариаций. Эта модель позволяет одновременно оценивать макрофаги человека с помощью проточной цитометрии, конфокальной микроскопии, анализа экспрессии мРНК, мультиплексных анализов растворимых факторов и количественного определения бактерий с использованием экспрессии GFP или колониеобразующих единиц.