Простой сухой метод секций для получения раздела смолы размером с цельное семя и его применения
23 января 2021 г.
Этот метод позволяет быстро и просто подготовить раздел смолы размером с цельное семя для наблюдения и анализа клеток, крахмала гранул и белковых тел в различных регионах семян.
Наука о морфологии и качество клеток, гранул крахмала и белковых тел в ядре определяют вес и качество семян. В этом исследовании мы представляем как простую популяцию целого ядра, встроенного в LR White смолу, и устанавливаем простой сухой метод всасывания целых ядер. Мы выбираем LR Белая смола в качестве встроенной среды по двум основным причинам.
Во-первых, это низкая вязкость и сильная проницаемость, что приводит к его хорошему применению в подготовке этого мощного раздела семян, особенно для зерновых зрелых ядер с большим объемом и высоким содержанием крахмала. Во-вторых, образец, встроенный в LR Белая смола может быть легко окрашены со многими химическими красителями, чтобы четко проявлять морфологию образцов под светом с флуоресцентным микроскопом. Подготовленные разделы могут быть специально окрашены, чтобы показать клетки, крахмал гранулы, и белковые тела четко в появлении всего ядра, и параметры морфологии также могут быть количественно проанализированы.
Метод содержит исследования. Здесь мы используем зрелые ядра кукурузы с большим объемом и высоким содержанием крахмала в качестве образца для выставки процессов шаг за шагом. Для начала зажимы ядра в простую бутылку.
Добавьте около 10 миллиметров 2,5%фосфат-буферного глутаралдегида. еще один рН 7,2 и поместите его на 4 градуса по Цельсию в течение 48 часов, чтобы исправить их обоих. Затем выньте эти ядра и нарежьте их продольно или поперечно, толщиной от двух до трех миллиметров.
Вам нужен острый двусторонний лезвие. И починить их еще на 48 часов. Затем, мыть образцы три раза около 10 миллиметров, так что 0,1 М фосфат буфера, рН 7,2 в течение 30 минут каждый раз.
Чтобы увлажнить образцы шаг за шагом, замочите их примерно в 10 миллиметров 30%этанола aqueous раствор в течение 30 минут во-первых, и последовательно замочить их в 10 миллиметров, так что 50%70%90%один раз, и 100%3 раза. Чтобы проникнуть в образец шаг за шагом, последовательно получить их с 10 миллиметров LR Белая смола раствор разбавлен этанолом 25%50%75%один раз, и 100%дважды при четырех градусах по Цельсию в течение 12 часов каждый раз. Перед встраиванием необходимо подготовить пьедесталы к образцам.
Добавьте 250 микролитров чистой белой смолы LR в две миллиметры центрифуги трубки и полимеризовать его при шести градусах по Цельсию в течение 48 часов. Затем последовательно добавляйте 500 микролитров чистой LR белой смолы и проникайте в образец в центрифугу с пьедесталом. После выпрямления образцов анатомической иглой поставь смолу на шесть градусов по Цельсию в духовку на 48 часов.
Выньте эти встроенные ядра из центрифуги трубки и вырезать избыток смолы вокруг образца с помощью резкого лезвия. Поместите блок смолы в образец держателя микротона и обрезать излишние смолы на поверхности образца и вокруг образца с лезвием. Далее полировать поверхность образца, наконец, со стеклянным ножом, пока полный раздел может быть сформирован.
Теперь пришло время подготовить этот удивительный раздел с толщиной два микрона. Перед нарезкой, положить небольшой меди говорил около двух миллиметров над краем лезвия, чтобы предотвратить раздел от керлинга. Как раздел удлиняет, положить говорил под раздел, чтобы поддержать его.
Затем добавьте 100 микролитров воды на непроверенный слайд и тщательно перенесите полный и непрерывный участок в воду с помощью угодников. Нагрейте и высушите их при температуре 50 градусов по Цельсию, чтобы сгладить морщинистую секцию. Наконец, два важных совета нуждаются во внимании.
Во-первых, если секция рушится или слезы, продлить время для каждого проникновения смолы образца. Во-вторых, если секция имеет несколько линий, параллельных ножу, плотно зажимайте блок образца. Если секция имеет некоторые линии вертикальной к ножу, пожалуйста, используйте новый нож.
Чтобы наблюдать морфологию клеток, крахмала гранул и белковых тел, мы можем испачкать секции флуоресцентным осветлением 28, раствором йода и блестящим синим R250 Кумасси соответственно. Для других конкретных пятен, основывать его на предложении исследования. Здесь мы используем раствор йода, чтобы испачкать гранулы крахмала в качестве примера.
Добавьте 40 микролитров раствора йода, чтобы погрузить секцию. И держать его в банке в течение одной минуты. А затем накройте образец рукавом крышки.
И смыть избыточное решение агента вокруг него. Наблюдайте и фотографуйте образец непосредственно под подсвещаемый микроскоп, оснащенный камерой видеонаблюдения. Мы можем обрабатывать и количественно анализировать сфотографированные изображения для области, длинного или короткого доступа и округливости клеток, гранул крахмала и белковых тел в разных регионах для ядра с помощью программного обеспечения для анализа морфологии.
Мы устанавливаем простой сухой метод сечения для удержания целых секций размером с ядро в смоле LR White. Метод может подготовить поперечные и продольные секции всего ядра с двумя микронами. или примеры, зрелое целое семя рапса масляного семени может быть поперечно и продольно.
Успешно могут быть успешно подготовлены и участки зрелого целого ядра кукурузы с большим объемом. Кроме того, с помощью метода можно изукомить развиваемое ядро, приготовленное ядро и проросное ядро. Подготовленные разделы целых ядер имеют ниже приложения.
Во-первых, участки всего ядра могут быть использованы для наблюдения за структурой тканей семян. Например, разделы всего эмбриона масляного рапса, окрашенные сафранином, могут ясно показать, что это радикальная, гипер-случайная, внутренняя и внешняя части целого ядра могут быть использованы для наблюдения и анализа морфологии клеток. Например, поперечные участки целого эмбриона масляного рапса окрашены флуоресцентным осветлением 28, а клеточные масла окрашены специально.
Микроморфология клеток в любых регионах всего эмбриона может отображаться при высоком увеличении. Параметры морфологии паренхимальных клеток, могут быть количественно проанализированы с помощью программного обеспечения анализа морфологии и показать некоторые различия в различных регионах эмбриона. Поперечные участки целого ядра кукурузы, окрашенные флуоресцентным осветлением 28, также могут проявляться как морфология клеток, а параметры морфологии клеток различны в различных областях эндосперма.
участки целого ядра могут быть окрашены раствором йода, чтобы продемонстрировали свою морфологию крахмала гранул, например, поперечные и продольные участки ядер кукурузы, окрашенных йодом, могут ясно проявлять свою морфологию крахмальных гранул. Гранулы крахмала в различных регионах показывают значительно различную морфологию, размер и количество в эндоспермовых клетках. Таким образом, количественный анализ морфологических параметров гранул крахмала показывает, что они значительно отличаются в различных регионах для эндосперма.
Разделы могут быть использованы для наблюдения и анализа морфологии белковых тел. Например, крахмал белка окрашенных синий использованием Coomassie блестящий синий R250. Пространственное распределение белка крахмала во всем эмбрионе рапса масляного сеяного может наблюдаться в его низком увеличении, и микро структура может быть выставлена четко при высоком увеличении.
Кроме того, можно количественно проанализировать индекс погрешности чисел и параметры морфологии белковых тел в выбранных регионах. Этот метод обеспечивает первое и простое приготовление секций смолы из целых ядер из развивающихся и зрелых семян. Секционные применения в структуре тканей всего ядра, а затем изучение морфологии клеток, крахмала гранул, и белковых тел в различных регионах целого ядра.
Приобретенные изображения могут быть количественно проанализированы, чтобы показать параметры морфологии клеток, крахмала гранул и белковых тел и далее сравнить их в разных регионах целого ядра.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен простой метод приготовления смоляных срезов размером со все семя для наблюдения и анализа клеток, крахмальных зерен и белковых телец в зернах кукурузы. Использование смолы LR White позволяет эффективно окрашивать и визуализировать образцы, что способствует проведению детальных морфологических исследований.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Морфология семян
- Анализ структуры клеток
- Методы окрашивания для визуализации
Теоретические основы
- Качество семян зависит от морфологии клеток и гранул.
- В качестве модельной системы используются зрелые зерна кукурузы с высоким содержанием крахмала.
- Существующие методы могут быть громоздкими, поэтому необходим упрощенный подход.
Используемые методы
- Заливка целых зерен в смолу LR White для последующего срезания.
- Использование специального протокола окрашивания клеточных компонентов.
- Количественный анализ морфологических параметров с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
Основные результаты
- Данный метод эффективно сохраняет морфологию ядра для детального наблюдения.
- Срезы можно окрашивать для четкой визуализации клеточных структур.
- Количественный анализ выявил различия в морфологии клеток в разных областях.
Выводы
- В исследовании представлен практический подход к изучению морфологии семян.
- Данный метод может быть полезен в исследованиях, касающихся качества семян и биологии развития.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод позволяет проводить морфологический анализ тканей семян с высоким разрешением, что способствует валидации мишеней в сельскохозяйственной биотехнологии за счет уточнения клеточных и субклеточных структур, имеющих решающее значение для развития признаков. Количественный анализ крахмальных зерен и белковых телец дает понимание механизмов для идентификации перспективных целей в программах по улучшению сельскохозяйственных культур. Этот подход повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, обеспечивая воспроизводимое, регион-специфичное фенотипирование развития и прорастания семян.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связанные с путями накопления питательных веществ в семенах.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет четкой визуализации морфологии клеток, крахмальных гранул и белковых тел.
- Трансляционная ценность: повышает уверенность в выборе мишени путем установления связи между структурными фенотипами и функциональными результатами качества семян.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать стандартизированные срезы цельных семян, подходящие для воспроизводимого окрашивания и визуализации.
- Количественные показатели: позволяет измерять морфологические параметры (площадь, округлость, размер) для применения в высокопроизводительном скрининге.
- Масштабируемость: совместимость с моделями крупных семян, такими как кукуруза, что позволяет повторно использовать платформу для различных видов сельскохозяйственных культур.
Трансляционные и доклинические исследования
- Система, имеющая значение для заболевания: Применима к проросшим, вареным и развивающимся семенам для изучения переходов в развитии.
- Механистическое снижение рисков: Связывает морфологические изменения в крахмале и белковых тельцах с функциональными признаками качества семян.
- Прогностическая ценность: Позволяет принимать решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков путем количественной оценки региональной неоднородности накопления запасных соединений.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод встраивается в рабочие процессы раннего поиска, предоставляя данные структурного фенотипирования, которые используются на этапах идентификации перспективных соединений и доклинической валидации при разработке сельскохозяйственных признаков.
- Фундаментальная биология: Поддерживает проверку гипотез, обеспечивая визуализацию клеточных и субклеточных компартментов в тканях семян.
- Скрининг: Позволяет получать срезы, готовые к анализу и совместимые с визуализацией высокого разрешения для морфологического скрининга.
- Аналитика: Предоставляет количественные морфометрические данные (площадь, округлость, доступность) для сравнительного анализа различных областей семени.
- Трансляционные исследования: Связывает структурные наблюдения с функциональными результатами развития и прорастания семян.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу для анализа целых семян различных сельскохозяйственных культур на разных стадиях развития.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в локализации соединений в 저장ных органах.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированных протоколов заливки смолой и изготовления срезов.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки сельскохозяйственных культур, обеспечивая возможность раннего фенотипирования ключевых признаков качества.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию признаков с учетом рисков на основе количественных морфологических конечных точек.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области гистологической подготовки образцов и методов заливки смолой.
- Зависит от наличия микротомов, стеклянных ножей и систем флуоресцентной микроскопии.
- Необходима стандартизация протоколов окрашивания (флуоресцентный отбеливатель 28, йод, кумасси синий) между исследовательскими группами.
- Требует учета особенностей адаптации для семян разного размера, с различным содержанием крахмала и на разных стадиях развития.
- Ограничено проблемами сохранения целостности срезов в образцах с высоким содержанием крахмала или волокон, что требует оптимизации времени инфильтрации.
