Разработка и тестирование специфических видов Количественные анализы ПЦР для применения ДНК окружающей среды

Хорошо оптимизированные анализы жизненно важны для правильной интерпретации данных ДНК окружающей среды. В этом протоколе описываются необходимые этапы проектирования и тестирования для разработки такого анализа. В целом, экологическая ДНК является неинвазивным методом обнаружения определенного вида или группы видов.

Это может снизить затраты и быть более чувствительным по сравнению с традиционными методами обследования. Этот метод может помочь в сохранении и управлении дикой природой за счет обнаружения ДНК интересующего вида, что позволяет потенциально сделать вывод о присутствии этого вида в исследуемом районе. Из-за высокой чувствительности количественной ПЦР загрязнение может произойти легко, и необходим отрицательный контроль для определения этапов, на которых произошло заражение.

eDNA — это область, изобилующая жаргоном и сокращенными терминами. Для тех, кто не занимается молекулярной биологией или количественной ПЦР, визуальные демонстрации могут помочь в планировании экспериментального дизайна от концептуализации до получения данных. Демонстрировать процедуру будут Даннис Руис Рамос, биолог из нашей лаборатории, и Труди Фрост, студентка-лаборантка.

Для начала выполните поиск и загрузите последовательности из нескольких областей гена для интересующих видов с помощью базы данных нуклеотидов NCBI. Выберите все последовательности, которые соответствуют спецификациям, и нажмите «Отправить».Выберите «Завершить запись», «Файл», «Формат загрузки» как GenBank или FASTA, а затем «Создать файл». Теперь эти последовательности сохраняются на компьютере.

Повторите эти действия для всех интересующих видов. Последовательности для каждого участка гена храните в отдельном файле, так как они будут анализироваться отдельно. Чтобы выровнять последовательности из каждой области гена по отдельности, импортируйте загруженные файлы последовательностей в программу выравнивания последовательностей, такую как программное обеспечение Geneious Prime.

Создайте отдельные папки для каждой области гена, а затем выберите все последовательности в папке, содержащей последовательности из одной области гена. Используйте инструмент «Множественное выравнивание» для создания нуклеотидного выравнивания, например, Geneious или MUSCLE выбранных последовательностей. Выбирайте перспективные регионы для проектирования анализов с помощью визуализации выровненных данных последовательностей.

Выберите регион, в котором доступно много данных о последовательностях для интересующего вас вида, который сильно отличается от одного вида и имеет низкую внутривидовую изменчивость. Затем спроектируйте праймеры и зонд. Используйте программное обеспечение для разработки анализов количественной ПЦР для разработки пяти наборов анализов количественной ПЦР.

Вставьте выбранный эпизод в поле Ввод последовательности. Если в результате выравнивания образовались пробелы, удалите их из последовательности. Выберите зонд праймеров qPCR 2 в опции «Выберите дизайн», затем загрузите рекомендуемые анализы.

Скопируйте последовательности из прямого праймера первого пробы, и найдите эту последовательность праймера в ранее созданном выравнивании. Если вы используете Geneious Prime, используйте инструмент «Аннотация прогноза», чтобы добавить область праймера к выравниванию. Проделайте это для всех комбинаций праймера и щупа.

Осмотрите эти области выравнивания на предмет вариаций как внутри целевого вида, так и внутри совместно встречающихся видов. Испытайте капсюли in silico с помощью праймер-бласта NCBI. Вставьте праймеры в использовать свой собственный праймерный бокс в разделе «Параметры праймера».

В опциях Primer Pair Specificity Checking Parameters выберите NR в качестве базы данных и введите таксономический порядок или семейство интересующего организма в поле Organism. Убедитесь, что выбранные грунтовки вряд ли будут усиливать нецелевые виды. Проверьте эффективность анализа in vitro путем создания стандартной кривой и определите эффективность кривой и линейный диапазон.

Протестируйте по меньшей мере шесть десятикратных разведений синтетического стандарта ДНК, содержащего целевую последовательность, примерно от одной до миллиона копий на реакцию. Используйте программное обеспечение для количественной ПЦР для построения графика значения CQ каждого стандарта по оси Y и логарифмического основания 10 начальной концентрации стандарта в копиях на реакцию по оси X. Программное обеспечение для количественной ПЦР должно автоматически запустить линейную регрессию.

Вычисление эффективности по наклону регрессии. Визуально проверьте стандартную кривую на предмет смещения или низкой производительности, измеренной по значениям КПД и R-квадрат. Используйте внутренний положительный контроль для проверки на ингибирование ПЦР фактических полевых образцов, что может привести к снижению чувствительности и ложноотрицательным результатам.

Определите пределы обнаружения и количественного определения для каждого анализа. Протестируйте анализы с нецелевыми видами, чтобы проверить специфичность, и убедитесь, что анализ хорошо работает с мультиплексированием ППК. Анализы с хорошей чувствительностью, специфичностью и эффективностью можно переходить к следующим этапам.

Для проведения испытаний анализа in situ необходимо получить несколько проб воды и обработать их для количественной ПЦР. Проведите количественный ПЦР-анализ и сравните концентрацию и частоту обнаружения эДНК с известными различиями в распространенности и распространенности. Подтвердите все обнаружения с помощью секвенирования.

Доступные последовательности всех видов Unionidae в реке Клинч были загружены и выровнены. После разработки нескольких анализов к выравниванию были добавлены пять наборов праймеров и зонда для визуальной оценки. Наборы праймеров и зондов были испытаны in silico и in vitro.

В лаборатории все анализы были протестированы с использованием экстракции ДНК 27 доступных видов для проверки специфичности. Один из анализов успешно амплифицировал только целевые виды. Здесь показан успешный анализ с хорошей эффективностью и значениями R-квадрат.

LOD и LOQ для выбранного анализа составляли по пять копий на реакцию. Напротив, анализы, которые давали стандартную кривую с низкой эффективностью, были отброшены. При качественной количественной ПЦР стандартные разведения амплифицируются при равномерно распределенных значениях количественного определения примерно 3,3 цикла для каждой десятикратной разницы в концентрации.

При плохой количественной ПЦР стандарты могут демонстрировать неравномерные различия в значениях количественного определения цикла между разведениями. Амплификацию МПК для неизвестных образцов следует сравнивать с результатами отрицательного контрольного МПК матрицы. Если в образцах отсутствуют ингибиторы, все амплификации ПЛИК должны иметь плотную группировку на графике, при этом значения количественного определения цикла должны быть почти такими же, как и при контроле без шаблона.

Для тестирования анализа in situ участки локализации включали дно русла мидий в ручье, дно мышечного русла у берега, в 100 метрах вниз по течению от русла в ручье, в 500 метрах вниз по течению от русла в ручье и в 500 метрах вниз по течению от русла у берега. Количественные ПЦР-анализы на ДНК окружающей среды могут помочь в мониторинге как инвазивных, так и исчезающих видов, а также улучшить наше понимание пространственных и временных изменений при обнаружении видов без необходимости физического захвата отдельного организма.