Одноклеточная мультиплексированная флуоресцентная визуализация для визуализации вирусных нуклеиновых кислот и белков и мониторинга ВИЧ, HTLV, HBV, HCV, вируса Зика и инфекции гриппа

Наш мультиплексный иммунофлуоресцентный клеточный подход к детектированию ДНК, РНК и белков позволяет нам одновременно визуализировать белки и нуклеиновые кислоты различных типов и цепочек в отдельных клетках. Перед посевом инкубируйте крышку в этаноле в течение пяти минут, после чего следует две двухминутные промывки в PBS. После второй промывки, полностью погрузите чехол в 20 микрограмм на миллилитр поли-D-лизина на 30 минут при комнатной температуре.

В конце инкубации удалите избыток матричного раствора с помощью двух промывок в PBS и разбавьте интересующие клетки в соотношении от 1 x 10 до шестой клетки на 50 микролитров PBS на концентрацию покровного скольжения. Затем засейте 50 микролитров интересующих клеток на каждую покровную пластинку, покрытую поли-D-лизином, для 30-минутной инкубации при комнатной температуре. По окончании инкубации клетки трижды промыть в PBS перед фиксацией в 4%-ном параформальдегиде на 30 минут.

В конце инкубации промойте клетки два раза в PBS перед пропиткой клеток 500 микролитрами 0,1%Tween 20 в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. В конце инкубации промойте каждый чехол два раза, добавив 500 микролитров свежего PBS на одну стирку. Чтобы обездвижить защитное стекло на предметное стекло, нанесите небольшую каплю прозрачного лака для ногтей на стерилизованное стекло и поместите один край свободной от ячеек защитного стекла на каплю лака для ногтей и опустите защитное стекло на сторону ячейки предметного стекла вверх.

Добавьте несколько капель PBS на иммобилизованный покровный листок, чтобы предотвратить обезвоживание клеток, и с помощью гидрофобной барьерной ручки нарисуйте круг вокруг внешней стороны покровного стекла. Когда барьер будет нарисован, замените PBS 100 микролитрами протеазы III и поместите предметное стекло в инкубатор с температурой 40 градусов Цельсия на 15 минут. По окончании инкубации дважды промойте предметные стекла в свежем PBS по две минуты за одну промывку с укачиванием.

После второй промывки разведите интересующий зонд в 200 микролитрах гибридизационного буфера при температуре 67 градусов Цельсия на 10 минут. В конце инкубации добавьте 50 микролитров раствора зонда в каждую крышку и поместите стекла во влажную духовку при температуре 40 градусов Цельсия на два часа. В конце инкубации промойте предметные стекла два раза с помощью буфера для свежей промывки и покачивайте в течение двух минут за одну промывку.

После второй промывки постучите по предметным стеклам, чтобы удалить излишки буфера, и последовательно обработайте защитные стекла одной каплей усилителей для флуоресцентных каналов 1, 2 и 3 в течение 30-минутной инкубации при температуре 40 градусов Цельсия на усилитель с двумя двухминутными промывками в буфере для свежей промывки с покачиванием на промывку между процедурами. После последней промывки добавьте каплю флуоресцентного усилителя канала 4 на защитный лист для 15-минутной инкубации в духовке при температуре 40 градусов Цельсия и промойте затвор два раза с помощью буфера для промывки и один раз с PBS, как показано на рисунке. Для иммуноокрашивания интересующих белков после последней промывки обработайте каждую покровную пачку 200 микролитрами блокирующего буфера в течение одного часа инкубации при комнатной температуре.

В конце инкубации сцедите блокирующий буфер и добавьте 200 микролитров первичного антитела, разведенного в PBS плюс Tween 20, дополненного 1% бычьим сывороточным альбумином. После одночасовой инкубации при комнатной температуре промойте предметные стекла двумя 10-минутными промывками в свежем PBS плюс Tween 20 с встряхиванием за промывку перед маркировкой образцов подходящим вторичным антителом в течение одного часа при комнатной температуре. В конце инкубации дважды промойте предметные стекла свежим PBS плюс Tween 20 в течение 10 минут с встряхиванием за одну промывку.

После второй промывки закрасьте ядра соответствующим ядерным красителем в течение одной минуты при комнатной температуре, после чего последует два промывки в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре с встряхиванием. Чтобы установить образцы для визуализации, поместите одну каплю раствора для защиты от выцветания на одно новое стерильное предметное стекло для каждого образца и распределите раствор так, чтобы он покрыл область, примерно равную размеру покровных стекол. Отсоедините чехлы от слайдов и погрузите чехлы в PBS.

Используйте щипцы, чтобы удалить остатки лака для ногтей, и высушите заднюю часть чехла салфеткой лабораторной салфеткой. Затем аккуратно поместите каждый образец крышки стороной вниз на раствор для защиты от выцветания и дайте образцам высохнуть в течение ночи. В качестве доказательства концепции этой процедуры ДНК, РНК и белок ВИЧ-1 были одновременно помечены и визуализированы микроскопически на уровне одной клетки.

В этом примере два генома ДНК ВИЧ-1 могут быть визуализированы в пределах одной клетки, поскольку они активно транскрибируют вирусную РНК. Вирусная РНК экспортировалась через ядерный поровый комплекс, а вирусный белок синтезировался в цитоплазме. Как было замечено, перекрестная реактивность между наборами зондов между двумя вирусами практически отсутствует, несмотря на мечение двумя ретровирусами с потенциалом перекрестной реактивности зонда.

Кроме того, окрашивание вирусной РНК может быть устранено, если клетки обрабатываются РНКазой во время подготовки образца. Затем можно количественно определить среднюю интегральную интенсивность флуоресценции сигнала антитела на клетку на каждом изображении. Как было замечено, количество прегеномной РНК HBV и общей РНК HBV увеличивается в течение инфекции HBV.

Визуализация инфекции ВГС также может быть выполнена с помощью конфокальной микроскопии с использованием 60-кратного масляного иммерсионного объектива для обнаружения интересующих флуорофоров. Этот высокоспецифичный подход также позволяет отслеживать вирусные или клеточные процессы с высоким пространственным временным разрешением. Кроме того, этот метод может быть использован для изучения множества вирусов и других патогенов.