Геномная инженерия первичных клеток человека B с использованием CRISPR/Cas9

Этот протокол позволяет исследователям точно устранять ген в В-клетках для изучения эффектов потери функции этого гена или вставлять транс-ген для стабильной экспрессии транс-генов, который может быть использован в исследовательских или терапевтических целях. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает универсальную платформу, которая позволяет легко и точно проектировать В-клетки с высокой эффективностью. Этот метод может быть использован для создания В-клеток для экспрессии рекомбинантных антител или ферментов, а затем для переноса этих В-клеток для лечения инфекций или при ферментопатиях.

Для начала разморозьте В-клетки на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Пока ждете, переложите два миллилитра предварительно подогретого FBS в стерильную 15-миллилитровую коническую трубку. Как только В-клетки полностью разморозятся, немедленно добавьте в образец один миллилитр предварительно подогретого FBS, по каплям.

Выдерживать при комнатной температуре в течение одной минуты. Осторожно с помощью пипетки повторно суспендируйте образец и переведите весь объем, по каплям, в коническую пробирку, содержащую два миллилитра предварительно подогретого FBS. Доведите объем до 15 миллилитров с помощью стерильного PBS, затем закройте пробирку крышкой и аккуратно переверните ее два-три раза.

Центрифугируйте образец при 400-кратном G в течение пяти минут, затем выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Повторно суспендируйте гранулу одним миллилитром предварительно уравновешенной среды для расширения В-клеток и подсчитайте клетки. Общее количество ячеек должно составлять примерно от 10 до седьмой клетки.

Переложите клетки в колбу, содержащую 20 миллилитров предварительно уравновешенной среды для расширения В-клеток. Конечная концентрация клеток, должна составлять примерно пять умно-10 на пятую клетку на миллилитр. Инкубируйте колбу вертикально в инкубаторе для тканевых культур.

Приготовьте трансфицирующий субстрат CRISPR/Cas9, смешав один микрограмм химически модифицированной sgРНК с 1,5 микрограммами мРНК ядра Cas9 химически модифицированного streptococcus pyogenes за одну реакцию трансфекции. Для контроля добавьте один микролитр TE-буфера вместо sgRNA в 0,2-миллилитровую пробирку из восьми полосок. Включите электропоратор и приготовьте реагенты для ядерного заражения.

Подсчитайте и перенесите 1 миллион В-клеток за одну реакцию трансфекции в стерильную коническую пробирку. Доведите объем до 15 миллилитров с помощью стерильного PBS и центрифугируйте при 400-кратном G в течение пяти минут. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость.

Повторно суспензируйте клетки с помощью 10 миллилитров стерильного PBS и центрифугируйте при 400-кратном G в течение пяти минут, затем полностью выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Добавьте в клеточную гранулу 0,5 мкг химически модифицированной мРНК GFP на 1 миллион В-клеток. Повторно суспендируйте гранулу с 20 микролитрами реагента для трансфекции первичных клеток на 1 миллион В-клеток и аккуратно перемешайте пипетированием пять-шесть раз.

Перелейте 20,5 микролитров за реакцию трансфекции в 0,2-миллилитровые пробирки, содержащие реагент CRISPR/Cas9. Сделайте пипеткой вверх и вниз по одному разу, чтобы перемешать и перенести весь объем в трансфекционную кювету. Закройте крышку и осторожно постучите кювету по скамье, чтобы жидкость покрыла дно кюветы.

Для трансфекции используйте протокол первичных В-клеток человека на электропораторе. Отдохните электропорированные ячейки в кювете при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем перенесите 80 микролитров предварительно уравновешенной среды для расширения В-клеток в реакцию трансфекции в кювете.

Поместите кювету в инкубатор для тканевых культур на 30 минут. Осторожно через трубчатую головку пару раз перемешать и перенести весь объем образца из кюветы в соответствующую лунку 48-луночной тканевой культуральной тарелки, содержащую один миллилитр среды для расширения В-клеток. Конечная концентрация клеток должна составлять 1 миллион клеток на миллилитр.

Проводя эксперимент по вбиванию генов, перенесите рекомбинантный аденоассоциированный вирусный вектор шестого типа при 500 000 кратности инфекции в соответствующую лунку, содержащую электропорированные клетки. Поместите планшет в инкубатор для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа с влажностью. В эксперименте с нокаутом количество В-клеток показало более 80% жизнеспособных клеток с небольшим снижением восстановления клеток как в контрольной группе, так и в образцах с нокаутом CD19 через 24 часа после электропорации.

В-клетки были собраны на пятый день после трансфекции для проточной цитометрии и анализа приливов. Репрезентативные диаграммы рассеяния контрольной и нокаутной выборок показали 14 и 95% CD19 отрицательных клеток соответственно, демонстрируя значительное снижение экспрессии CD19 в нокаутных образцах. Хроматограммы геномного секвенирования показали двойные пики в нокаутных В-клетках CD19, указывающие на вставки или делеции нуклеотидов после двухцепочечных разрывов, опосредованных CRISPR/Cas9.

Индель-анализ хроматографов нокаутных образцов показал высокий процент образования индела в локусе CD19, что согласуется с процентом потери белка CD19, обнаруженным с помощью проточной цитометрии. В-клетки из эксперимента были собраны на 12-й день, после инженерии. Диаграммы рассеяния показали 64% EGFP-положительных клеток в образце, получивших рекомбинантный аденоассоциированный вирусный вектор шестого типа, вместе с RNP, в то время как в контрольной и только векторной выборках не наблюдалось никакого или минимального положительного результата EGFP соответственно.

Амплификация ПЦР на переходе показала ампликоны пар оснований 1,5 килооснования в пробе, и ни в контрольной, ни в векторной выборке продукт ПЦР не наблюдался. Подсчет клеток показал, что процесс конструирования влияет на восстановление клеток в пробе с нокау больше, чем в контрольных образцах или образцах, содержащих только вектор. Тем не менее, все образцы быстро восстановились в течение трех дней после проектирования.

Эта процедура также может быть использована для введения агентов редактора оснований для изменения одиночных пар оснований с целью индуцирования или коррекции одноточечных мутаций в геноме В-клеток. Он также может быть использован для введения преждевременных стоп-кодонов или для изменения сайтов сплайсинга, что позволяет создавать множественные нокауты генов без риска хромосомных транслокаций. До того, как был разработан этот метод, инженерия человеческих В-клеток требовала использования других, более сложных подходов к генной инженерии.

Этот метод является более простой, менее дорогой и быстрой альтернативой. Он также потенциально может быть использован для синтеза продуктов клеточной терапии для клинического использования.