Анализ проточной цитометрии на основе ДНК/Ki67 для анализа клеточного цикла антиген-специфических CD8 Т-клеток у вакцинированных мышей
5 января 2021 г.
Клональная экспансия является ключевой особенностью антиген-специфического ответа Т-клеток. Тем не менее, клеточный цикл Т-клеток, реагирующих на антиген, был плохо изучен, отчасти из-за технических ограничений. Описан проточный цитометрический метод анализа клонально расширяющихся антиген-специфических CD8 Т-клеток в селезенке и лимфатических узлах вакцинированных мышей.
Наш протокол обеспечивает практический подход, с помощью которого мышиная селезенка и лимфатические узлы могут быть использованы для отражения динамики ответа Т-клеток, превышающей обеспечение стационарного фенотипического снимка. Наш метод чувствительно обнаруживает антиген-специфические CD8 Т-клетки, которые участвуют в постоянном ответе. Пролиферирующие CD8 Т-клетки измеряются без возможных смешанных эффектов лечения препаратами in vivo или переноса клеток.
Наша методика может обеспечить окно в иммунную динамику в нескольких настройках. Например, в отношении ответа на вакцинацию и инфекции, аутоиммунные заболевания и иммунотерапию рака. Подготовьте свежий 1-кратный буфер для промывки пермеабилизации, разбавляя 10-кратный буфер пермеабилизации дистиллированной водой и фильтруя его через фильтр 0,45 микрометра для устранения заполнителей.
Разбавляют моноклональное антитело Ki67 FITC в 1x буфере промывки пермеабилизации, как определено в эксперименте по титрованию для конечного объема 100 микролитров на образец. Добавьте 3 миллилитра 1x проницаемого промывочного буфера в каждую трубку с ячейками и центрифугой при 400 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте супернатант.
Опять же, добавьте 1x проницаемый промывочный буфер и центрифугу к гранулированным ячейкам. Затем отбросьте супернатант. Добавьте в гранулу 100 микролитров разбавленного моноклонального антитела Ki67 FITC, затем вихрь и инкубируйте в течение 30 минут в темноте.
После инкубации дважды промывайте клетки 4 миллилитрами 1x буфера проницаемости, центрифугируя после каждой промывки, и выбрасывайте супернатант. Добавьте 350 микролитров PBS к клеточной грануле для образцов, которые будут получены непосредственно на проточном цитометре, и 250 микролитров PBS в гранулу клетки для образцов, которые будут инкубированы с Hoechst для окрашивания ДНК. Приготовьте раствор Hoechst и PBS и добавьте его в каждый образец так, чтобы конечная концентрация составляла два микрограмма на миллилитр.
Вихрь и инкубация образцов в течение 15 минут в темноте. Затем центрифугируйте образцы в течение пяти минут и добавьте 350 микролитров PBS в гранулу ячейки. Откройте программное обеспечение и создайте различные группы, соответствующие различным органам для анализа, щелкнув Создать группу» в разделе ленты рабочей области.
Откройте окно измененной группы, дважды щелкнув по имени группы, и синхронизируйте вновь созданные группы, вставив галочку на синхронизированную функцию. Перетащите каждый файл FCS в соответствующую группу, а затем создайте стратегию gating, начиная с группы a-LN. Откройте окно графика, дважды щелкнув по полностью окрашенному образцу, чтобы отобразить неочищенные события, полученные для образца, на точечном графике.
Обратите внимание, что оси X и Y помечены как в файлах FCS, как указано во второй таблице файла настроек проточного цитометра этой рукописи. Убедитесь, что отображается достаточное количество событий для соответствующей визуализации. При необходимости откройте настройки, щелкнув значок сердца на ленте рабочей области, выберите «Графики», затем «Точечный график» в качестве типа графика и проверьте правильность количества точек, нарисованных в соответствующем поле, или измените его.
Отображение неочищенных событий в окне графика в виде точечного графика с ДНК-A на оси x и DNA-W на оси Y. Используйте линейное масштабирование для обеих осей. При необходимости измените масштаб с логарифмического на линейный, нажав на поле, указанное буквой Т рядом с каждой осью в окне графика.
Выберите популяцию одной ячейки, щелкнув по прямоугольнику в разделе инструмента gating, а затем дважды щелкните в центре прямоугольного затвора, чтобы отобразить одиночные ячейки на точечном графике с параметром FSC-A на оси X и мертвой ячейкой на оси Y. Нажмите на полигон, чтобы выбрать популяцию живых клеток, которые являются отрицательными для мертвых клеток. Дважды щелкните в центре затвора полигона, чтобы отобразить ячейки на точечном графике с параметром FSC-A по оси X и параметром SSC-A по оси Y.
Нажмите на прямоугольник и создайте расслабленные ворота, чтобы включить все отдельные живые ячейки в этот график. Дважды щелкните в центре расслабленных ворот, чтобы отобразить ячейки на точечном графике с CD3 по оси X и CD8 по оси Y. Используйте соответствующую шкалу доступа для визуализации в окне графика.
При необходимости измените шкалу x и y, щелкнув по полю, обозначенному буквой T рядом с каждой осью, выберите «Настроить функцию доступа» и при необходимости измените дополнительные десятилетия с базами и положительными десятилетиями. Выберите CD3+CD8+ячейки, щелкнув по полигону. Дважды щелкните в центре затвора CD3+CD8+, чтобы отобразить ячейки на точечном графике с Tetr-gag на оси x и Pent-gag на оси Y.
Выберите антиген-специфические CD8 Т-клетки, нажав на полигон. Дважды щелкните в центре затвора, специфичного для кляпа, чтобы отобразить клетки на точечном графике с ДНК-A на оси X и Ki67 на оси Y. Выделите ячейки в различных фазах цикла ячеек, нажав на Quad" в разделе инструмента gating окна графика.
Скопируйте стратегию блокировки, созданную в одном образце, в соответствующую группу, чтобы применить ворота ко всем образцам группы. Затем скопируйте стратегии захвата для групп b-spleen и CBM, как описано в рукописи текста. Убедитесь, что все затворы подходят для каждого образца из трех групп.
При необходимости десинхронизируйте группу и измените ворота, как описано в рукописи. Отображение BM-клеток расслабленных ворот на точечном графике с ДНК-A по оси x и Ki67 по оси Y. Визуализируйте результаты, щелкнув Редактор макетов" в разделе ленты рабочей области.
Перетащите каждый вентиль стратегии затвора в области примера в редактор макета и разместите графики в соответствии с последовательностью затвора. При необходимости измените тип графика, дважды щелкнув по соответствующему графику в макете и выбрав соответствующий тип в окне определения графика. Нажмите на группу и выполните итерацию по функциям на ленте макета, чтобы визуализировать результаты, полученные в антиген-специфических CD8 Т-клетках из каждого органа и сравнить различные образцы.
Визуализируйте результаты клеток костного мозга, представляющих положительный контроль. Типичный пример анализа клеточного цикла клеток костного мозга показан здесь. Протокол дал низкий коэффициент вариации от G0 до G1 и от G2 до M пиков ДНК, что указывает на отличное качество окрашивания ДНК.
Для идентификации антиген-специфических CD8 клеток была использована пятиступенчатая стратегия гейтинга. Два мультимера были использованы для улучшения чувствительности обнаружения CD8 T-клеток у вакцинированных мышей без увеличения фона окрашивания у необработанных мышей. Кляп-специфические CD8 Т-клетки в дренирующих лимфатических узлах и в селезенке содержат высокую долю клеток в фазах S-G2 / M на третий день после повышения.
Кроме того, специфические для кляпа CD8 Т-клетки в фазах S-G2 / M имели высокий FSC-A и SSC-A при наложении на общие CD8 Т-клетки из того же органа. Офсетные гистограммы показали, что экспрессия CD62L специфическими для кляпа CD8 Т-клетками была низкой, как и ожидалось для активированных Т-клеток, за исключением нескольких клеток в G0 в лимфатических узлах. Этот метод предназначен для Т-клеток для достижения отличного качества окрашивания ДНК вместе с мембраной и окрашиванием Ki67.
Анализ данных проточной цитометрии является ключевым моментом. Обязательно используйте соответствующий контроль для позиционирования ворот. Используя этот метод, мы обнаружили Т-клетки в фазах S-G2 / M клеточного цикла в периферической крови мыши и человека.
Этот метод был полезен в исследованиях иммуномониторинга при диабете 1 типа, инфекционном мононуклеозе и COVID-19.
Обзор
В данном исследовании представлен метод проточной цитометрии для анализа клонально экспансирующих антигенспецифических T-клеток CD8 в селезенке и лимфатических узлах вакцинированных мышей. Данная методика позволяет выявлять T-клеточные ответы без влияния сопутствующих факторов, таких как введение препаратов in vivo или перенос клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Проточная цитометрия
- Биология Т-клеток
Теоретические основы
- Клональная экспансия имеет решающее значение для антигенспецифических ответов Т-клеток.
- Клеточный цикл активированных Т-клеток оставался недостаточно изученным из-за технических сложностей.
- Понимание динамики Т-клеток необходимо для глубокого анализа иммунных ответов.
- Данное исследование направлено на решение проблемы необходимости метода анализа ответов Т-клеток в режиме реального времени.
Цель исследования
- Разработка метода анализа антигенспецифических CD8 T-клеток in vivo.
- Получение данных о пролиферации T-клеток в ходе иммунного ответа.
- Облегчение изучения динамики T-клеток в различных иммунологических контекстах.
Используемые методы
- Приготовление свежего промывочного буфера для пермеабилизации при окрашивании клеток.
- Использование моноклональных антител Ki67 FITC для выявления пролиферирующих Т-клеток.
- Проточный цитометрический анализ для оценки популяций Т-клеток и состояний их активации.
- Стратегии гейтирования для выделения антигенспецифических CD8 Т-клеток из смешанных популяций.
Основные результаты
- Данный метод успешно выявляет антигенспецифические CD8 T-клетки, участвующие в активном иммунном ответе.
- Пролиферацию CD8 T-клеток можно точно измерить без влияния искажающих факторов.
- Этот метод позволяет получить представление о динамике T-клеток при вакцинации и инфекции.
- Результаты демонстрируют эффективность данного метода при изучении аутоиммунных заболеваний и иммунотерапии рака.
Выводы
- Разработанный метод проточной цитометрии эффективен для анализа Т-клеточных ответов.
- Данный подход расширяет понимание иммунной динамики в различных условиях.
- В будущих исследованиях этот метод может быть использован для изучения поведения Т-клеток при норме и патологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет проводить точный количественный анализ пролиферации антигенспецифических CD8 T-клеток in vivo, восполняя критический пробел в иммунологическом мониторинге при разработке вакцин и методов иммунотерапии. Разграничивая фазы G0, G1 и S-G2/M без использования нуклеотидных аналогов или разбавления красителя, метод обеспечивает механистический обзор динамики клональной экспансии. Это способствует валидации мишеней и идентификации перспективных соединений-лидеров путем установления связи между распознаванием антигена и функциональными пролиферативными состояниями в доклинических моделях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, сопоставляя антигенную специфичность с прогрессией клеточного цикла в реагирующих T-клетках.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимый результат проточной цитометрии для функциональной валидации мишени, независимо от ограничений BrdU или CFSE.
- Прогностическая ценность: способствует снижению механистических рисков путем количественного определения доли антигенспецифических T-клеток, перешедших в митоз, по сравнению с клетками в фазе G1 или G0.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных количественных результатов (DNA-A по отношению к Ki67), подходящих для высокопроизводительного скрининга кандидатов в вакцины или иммуномодуляторов.
- Воспроизводимость: использование Hoechst 33342 обеспечивает высокое разрешение при дифференциации пиков ДНК, что гарантирует стабильное разделение фаз G0/G1 и G2/M во всех образцах.
- Масштабируемость: метод совместим с анализом нескольких органов (селезенка, лимфатические узлы, костный мозг) и может быть адаптирован для доклинических видов животных для проведения сравнительных исследований.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболеваний: Применимо к исследованиям эффективности вакцин, что было продемонстрировано на мышах, вакцинированных вектором HIV-gag, у которых наблюдалось обогащение S-G2/M в антигенспецифических CD8 T-клетках.
- Трансляционная преемственность: Связывает этапы поиска и доклинических исследований, обеспечивая кинетически разрешенное измерение экспансии T-клеток, которое позволяет прогнозировать величину иммунного ответа.
- Решения с учетом рисков: Позволяет установить критерии принятия решения «идти/не идти» на основе пролиферативной кинетики антигенспецифических клонов, снижая зависимость исключительно от конечных фенотипических маркеров.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, позволяя на ранних стадиях оценить пролиферативную способность Т-клеток после иммунизации и предоставить данные для оптимизации ведущих соединений посредством функционального иммунного профилирования.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез, связывая распознавание антигена (с помощью MHC-мультимера) со стадией клеточного цикла, что позволяет определить, приводит ли взаимодействие к пролиферации или анергии.
- Скрининг: предоставляет количественные данные о распределении фаз клеточного цикла, готовые для анализа, что позволяет сравнивать вакцинные платформы или эффекты адъювантов на экспансию T-клеток.
- Аналитика: генерирует многопараметрические показатели (содержание ДНК, Ki67, скаттер-граммы, антигенную специфичность), позволяя проводить статистическое сравнение индексов пролиферации при различных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивает связь с доклинической валидацией путем идентификации активированных циклирующих подмножеств T-клеток, которые коррелируют с защитным иммунитетом в моделях инфекций и рака.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу иммунмониторинга для лонгитюдных исследований в рамках разработки препаратов для лечения аутоиммунных, инфекционных и онкоиммунологических заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при валидации мишени за счет разрешения пролиферативной гетерогенности внутри популяций антигенспецифических Т-клеток.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию благодаря фиксированной стратегии гейтирования и окрашиванию ДНК красителем Hoechst, что минимизирует вариабельность между анализами.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах снизить риски при отборе иммуномодулирующих кандидатов на основе функциональной кинетики Т-клеток.
- Влияние на портфель: позволяет принимать обоснованные решения о продвижении кандидатов с учетом рисков путем количественной оценки пролиферативной фракции антигенспецифических Т-клеток как биомаркера качества ответа.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с многоцветной проточной цитометрией, включая настройку компенсации для сигналов FITC-Ki67 и Hoechst.
- Необходим доступ к проточному цитометру с возможностью УФ-возбуждения для детектирования Hoechst 33342 и соответствующим наборам фильтров.
- Требуются стандартизированные протоколы пермеабилизации и промывки для сохранения целостности эпитопов Ki67, мультимеров и поверхностных маркеров.
- Необходима оптимизация концентрации Hoechst (2 µg/mL) и времени инкубации для предотвращения цитотоксичности при достижении оптимального разрешения пиков ДНК.
- Точность идентификации антигенспецифических Т-клеток зависит от правильной иерархии гейтирования, начинающейся с исключения дуплетов и мертвых клеток.
