Миниатюрный флуориметр с открытым исходным кодом для мониторинга реакций амплификации изотермических нуклеиновых кислот в режиме реального времени в условиях ограниченных ресурсов

Этот метод позволяет людям без опыта в области электроники создавать такие инструменты, как этот флуориметр для амплификации и обнаружения изотермических нуклеиновых кислот, что имеет решающее значение для молекулярной диагностики. Основным преимуществом данной методики является то, что система может быть полностью собрана из коммерчески доступных материалов и программного обеспечения с открытым исходным кодом при низких затратах. Этот флуориметр может использоваться с несколькими изотермическими методами амплификации.

Это важно, поскольку методы изотермической амплификации все чаще используются для выявления широкого спектра инфекционных и наследственных заболеваний. Чтобы собрать оптический корпус, поместите 3/16-дюймовую резьбовую вставку длиной 4-40 в отверстие поверх нижней части корпуса оптики STL и поместите резьбовую вставку длиной 1/4 дюйма 4-40 во все другие отверстия детали. Вставьте центральную испытательную плату в верхнюю полость корпуса с пятью контактами, обращенными к верхней и ближайшей к центральной оси устройства, и закрепите испытательную плату винтом длиной 3/16 дюйма 4-40.

Поместите один из объективов с фокусным расстоянием 20 миллиметров в секцию под центральной испытательной доской выпуклой стороной, обращенной к нижней части устройства и в стороне от испытательной доски. Чтобы создать первую конфигурацию, поместите фильтр длинных проходов в следующую секцию под объективом с фокусным расстоянием 20 миллиметров. Чтобы создать вторую конфигурацию, поместите две желтые пленки эмиссионного фильтра в секцию под объективом.

Чтобы создать первую конфигурацию, поместите дихроичное зеркало в диагональную секцию вблизи центра оболочки, соблюдая ориентацию фильтра, указанную производителем. Чтобы создать вторую конфигурацию, поместите светоотвод в диагональную секцию. Поместите второй объектив с фокусным расстоянием 20 миллиметров в секцию под дихроичным зеркалом или делителя луча в зависимости от конфигурации, причем выпуклая сторона направлена к верхней части устройства.

Чтобы создать первую конфигурацию, поместите фильтр возбуждения в секцию справа от дихроичного зеркала, убедившись, что стрелка указывает на дихроичное зеркало. Чтобы создать вторую конфигурацию, поместите одну синюю фольгу фильтра возбуждения в секцию справа от светоотвотрателя. Поместите объектив с 15-миллиметровым фокусным расстоянием справа от фильтра возбуждения выпуклой стороной лицом к дихроичному зеркалу.

И поместите светодиод в оставшуюся часть печати, а светодиод будет направлен к дихроичному зеркалу или разветвителю луча, в зависимости от конфигурации. Убедитесь, что два провода, ведущие от светодиода, вставлены в каналы углубления, чтобы печать плотно закрылась. И повторите настройку для другой стороны 3D-печати.

Затем поместите экструдированные части верхней половины оболочки в утопленные канавки нижней половины оболочки, чтобы закрыть пустую сторону куска оптическими компонентами. И закрепите детали вместе с помощью винтов длиной 3/8 дюйма 4-40. Чтобы собрать электронику и сенсорный экран, подключите две мини-макетные платы и поместите микроконтроллер в одну из макетных плат, гарантируя, что порт micro-USB микроконтроллера обращен наружу.

Чтобы подключить светодиодную модуляцию, подключите CTL-контакт драйвера LED+к цифровому контакту микроконтроллера. И LED-контакт светодиодного драйвера к GND-контакту микроконтроллера. Снимите пластиковые крышки на задней части макетных плат и прижмите клеевую подложку макетных плат к 3D-печатной части, чтобы прикрепить комбинированные макетные платы к внутренней части задней части держателя ЖК-экрана STL, напечатанного на STL.

Закрепите держатель ЖК-экрана с помощью собранных макетных плат внутри оптического корпуса с помощью винтов длиной 1 дюйм 4-40. Чтобы подключить светодиодный источник питания, подключите led-положительный контакт светодиодного драйвера к положительному проводу первого светодиода. И подключите отрицательный провод первого светодиода к положительному проводу второго светодиода на макетной плате.

Подключите отрицательный провод второго светодиода к LED-контакту светодиодного драйвера. Для подключения светодиодного блока питания используйте бочковой разъем к 2-контактному адаптеру для подключения положительного и отрицательного проводов 10-вольтового блока питания к VIN+ и VIN-контактам светодиодного драйвера соответственно. Чтобы подключить блок питания тестовой платы датчика и передачу данных, используйте 4-контактный провод от гнезда к мужской перемычке для подключения контактов SCK, SDA, VDUT и GND на платах тестирования датчиков light-to-digital к мини-макетной плате через зазор в правом верхнем углу отпечатка держателя ЖК-дисплея.

На макетной плате убедитесь, что 3,3-вольтовый контакт микроконтроллера и контакт VDUT обеих тестовых плат, GND-контакт микроконтроллера и GND-контакт обеих тестовых плат, аналоговый 4-контактный микроконтроллер и контакт SDA обеих тестовых плат и аналоговый 5-контактный микроконтроллер , и контакт SCK обеих испытательных плат соединен. Используйте четыре винта M2.5 для крепления одноплатного компьютера к держателю ЖК-экрана, при этом порты HDMI и адаптера питания одноплатного компьютера направлены вверх, а одноплатный компьютер сосредоточен на 3D-печатной детали. Затем подключите сенсорный дисплей к одноматному компьютеру в соответствии с инструкциями сенсорного экрана.

И подключите порт HDMI одноплатного компьютера к порту HDMI сенсорного экрана. Для записи данных флуоресценции в режиме реального времени после того, как тепловой блок был включен и достиг соответствующей температуры, включите одноплатный компьютер и используйте кабель micro-USB-USB для подключения одноплатного компьютера к микроконтроллеру. Откройте предоставленный скрипт Python на сенсорном экране и измените время измерения.

Измените путь к выходному файлу переменной на имя файла данных, создаваемого программой. И измените переменные последовательного порта на нужные значения. Поместите в тепловой блок две трубки ПЦР, содержащие реакции, которые необходимо контролировать.

И поместите флуориметр на тепловой блок с трубками ПЦР, центрированными между четырьмя колышками, выдавливающимися из каждого оптического канала. После подтверждения того, что 3D-печатный флуориметр подключен, подключите адаптер питания для светодиодов и запустите программу Python. На ЖК-экране появится графический пользовательский интерфейс для измерения флуоресценции в режиме реального времени в обеих ПЦР-трубках.

В конце эксперимента просмотрите измерения и файлы выходных данных, сохраненные в заданном пользователем расположении. После сборки производительность флуориметра может быть проверена путем измерения флуоресценции из серии разбавления красителя FITC. В этом репрезентативном анализе оба канала флуориметра показали линейный отклик в желаемом диапазоне.

Здесь показаны исходные вычитаемые флуоресценции положительной и отрицательной реакции управления армификацией полимеразы рекомбиназы и отрицательные реакции управления стандартного коммерческого комплекта, измеренные на второй конфигурации флуориметра. Измерения флуоресценции в режиме реального времени пользовательской реакции изотермической амплификации с петлевой обратной транскрипцией для РНК SARS-COVID-2 на первой конфигурации флуориметра показывают, что амплификация происходит, как и ожидалось, в клинически значимом диапазоне числа копий РНК. В то время, когда глобальные цепочки поставок очень напряжены, оборудование с открытым исходным кодом, такое как этот флуориметр, может помочь нам уменьшить некоторые неравенства в отношении здоровья, связанные с пандемией.