Миозин-специфические адаптации анализов подвижности на основе флуоресцентной микроскопии in vitro
4 февраля 2021 г.
Здесь представлена процедура экспрессии и очистки миозина 5а с последующим обсуждением его характеристики с использованием как ансамблевых, так и одиночных молекулярных флуоресцентных анализов in vitro на основе микроскопии, и как эти методы могут быть модифицированы для характеристики немузкулярного миозина 2b.
Этот протокол может быть использован для характеристики динамики немуклинового миозина на уровне белка, который может информировать о подвижных свойствах, которые способствуют их роли в клетках. Это быстрый, воспроизводимый и строго контролируемый метод, который можно использовать для изучения влияния различных регуляторных условий на подвижность миозина, информируя об их клеточном поведении. Эти методы могут быть использованы для исследования того, как болезнетворные мутации в немышечные миозинах влияют на их поведение на уровне одной молекулы и ансамбля.
Общий подход его методологии может быть применен к различным другим цитоскелетным системам, таким как характеристика очищенных кинезинов и динеинов микротрубочами. Универсальность этого протокола может вызвать вопросы о том, какие флуорофоры и химические условия наиболее подходят, но метод может быть оптимизирован относительно быстро. Понимание того, как настроить и покрыть прототочные камеры, создает прочную основу, на которой можно адаптироваться к различным условиям для этих экспериментов.
Для начала приготовьте однопроцентный раствор нитроцеллюлозы в амилацетате и поместите круглую фильтровальную бумагу диаметром 125 миллиметров на дно пластины для культивирование ткани. Загрузите восемь квадратных крышек на стойку и тщательно вымойте их примерно двумя-пятью миллилитрами 200-стойкого этанола, а затем двумя-пятью миллилитрами дистиллированной воды. Затем привод крышки полностью скользит с помощью фильтро-воздушной линии или азотной линии.
Медленно пипетку 10 микролитров однопроцентного раствора нитроцеллюлозы вдоль одного края одного скольжения крышки. Размажьте его по остальной части крышки, используя сторону 200-микролитрового наконечника пипетки одним плавным движением. Затем поместите этот покровный слип на чашку для культивирование тканей нитроцеллюлозной стороной вверх.
Повторите это для оставшихся листов крышки и дайте им высохнуть. Протрите слайд микроскопа бумагой для оптической линзы, чтобы очистить от крупного мусора. Вырежьте два куска двусторонней ленты, длиной примерно два сантиметра, и поместите один кусок вдоль середины длинного края предметной области микроскопа.
Поместите второй кусок ленты примерно на два миллиметра ниже первого куска ленты так, чтобы они были параллельными, создавая проточную камеру, которая может вместить примерно 10 микролитров раствора. Осторожно приклейте одну из нитроцеллюлозных чехлов на ленту так, чтобы сторона, покрытая нитроцеллюлозой, непосредственно контактировала с лентой. Используя наконечник пипетки, осторожно нажмите на интерфейс слайд-ленты, чтобы убедиться, что крышка правильно приклеивается к слайду.
Затем отрежьте лишнюю ленту, свисающую над краем горки лезвием бритвы. Подготовьте растворы для Миозина 5а и держите их на льду. Продуть в 10 микролитрах Миозина 5а через скользящую протоковую камеру и подождать одну минуту.
Затем протоите в 10 микролитрах по одному миллиграмму на миллилитр BSA в буфере подвижности с DTT. Повторите это дважды и подождите минуту после третьей стирки. Используйте угол папиросной бумаги или фильтровальной бумаги, чтобы провести раствор через канал, аккуратно поместив угол бумаги на выход из блок-камеры.
Затем промыть 10 микролитрами мотористого буфера с помощью DTT. Пипетка черного актинового раствора с помощью одного миллилитра шприца и иглы 27-го калибра для сдвига актиновых нитей перед введением этого раствора в камеру. Добавьте черный актин в камеру в присутствии одного миллимоляра АТФ в 50 миллимолярных МБ с одним миллимолярным DTT.
Далее текут в 50 микролитрах буфера подвижности с DTT и одним миллимоляром АТФ для истощения камеры свободных актиновых нитей. Промывайте 10 микролитрами буфера подвижности с DTT три раза, чтобы истощить камеру любого АТФ. Продуть в 10 микролитрах 20 наномолярного раствора резус-актина, содержащего буфер подвижности с DTT, и подождать одну минуту, чтобы обеспечить строгое связывание актиновых нитей с миозином 5а, прикрепленным к поверхности крышки.
Промывайте 10 микролитрами 50-миллимолярного буфера подвижности с DTT дважды, чтобы удалить несвязанный RH актиновых нитей. Расход в 30 микролитрах конечного буфера. Записывайте изображения на флуоресцентный микроскоп, используя длину волны возбуждения 561 нанометр для визуализации резус-актина.
Подготовьте растворы для анализа моторики Myosin 5a и держите их на льду. Промывайте их камерой с 10 микролитрами мотористого буфера с DTT. Расход в 10 микролитрах по одному миллиграмму на миллилитр BSA в буфере подвижности с DTT.
Повторите это дважды, подождав через минуту после третьей стирки. Используйте салфетку или фильтровальную бумагу, чтобы провести раствор через канал, осторожно поместив угол бумаги на выходе из проточной камеры. Затем трижды промыть камеру 10 микролитрами буфера подвижности с помощью DTT.
Протойте в 10 микролитрах раствора NeutrAvidin в буфер подвижности с DTT и подождите одну минуту. Затем трижды промыть 10 микролитрами этого раствора. Протекать в 10 микролитрах brh актина, содержащего буфер подвижности с DTT, используя большой наконечник пипетки.
И подождите одну минуту. Затем трижды промыть 10 микролитрами буфера подвижности с помощью DTT. Поток в 30 микролитрах конечного буфера с 10 наномолярами миозина 5а.
И сразу же загрузить на полное внутреннее отражение флуоресцентного микроскопа. Начните запись, как только будет найден оптимальный фокус для визуализации TIRF. Очистка немуклинального миозина 2b, эссенциалных легких цепей и регуляторных легких цепей, а также миозина 5а и кальмодулина оценивалась путем выполнения SDS-PAGE.
Анализ скользящей актиновой нити показывает характеристики идеального и отслеживаемого фильма с плавными движениями меченых актиновых нитей. Черная актиновая промывка гарантировала, что мертвые головки миозина были удалены из поля измерения, что еще больше способствовало общему плавному движению актиновых нитей. Выходные изображения отслеживания нити из программы fast track были получены для немуклиновых Myosin 2b и Myosin 5a.
Репрезентативная гистограмма показывает, что скорость скольжения Actomyosin 2b составляет 77 нанометров в секунду. А у Actomyosin 5a — 515 нанометров в секунду. В отсутствие метилцеллюлозы актиновые нити не остаются так тесно связанными поверхностью, покрытой миозином, в результате чего она плюхает близко к поверхности немышельных покрытий, покрытых миосином 2b.
Движение миозина наблюдалось на поверхностно-привязанных флуоресцентных актиновых нитях с использованием перевернутого анализа подвижности. Важно срежевать немаркированный актин перед введением его в проточную ячейку для промывки черного актина, что позволит плавно транслокировать актин. Дополнительные эксперименты могут исследовать, как на подвижность миозина влияют мутации миозина, вызывающие нагрузку белки, ионная сила и регуляторные белки.
Различные клеточные состояния могут быть восстановлены для будущих исследований. Эти методы позволяют проводить биохимические и биофизические исследования того, как различные изоформы миозина различаются по своим подвижным и механическим свойствам на уровне одной молекулы и ансамбля.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе подробно описаны экспрессия и очистка миозина 5a с последующей характеризацией с помощью методов флуоресцентной микроскопии in vitro. Также рассматриваются модификации для изучения немышечного миозина 2b.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Клеточная биология
- Нейронауки
Теоретическая часть
- Миозины играют критическую роль в клеточной подвижности.
- Понимание динамики миозинов необходимо для выяснения их функций в клетках.
- Немышечные миозины участвуют в различных клеточных процессах.
- Методы характеризации позволяют выявить влияние мутаций на поведение миозина.
Цель исследования
- Характеристика динамики немышечного миозина на белковом уровне.
- Изучение двигательных свойств, определяющих функции белка в клетке.
- Исследование влияния регуляторных условий на подвижность миозина.
Используемые методы
- Ансамблевая и одномолекулярная флуоресцентная микроскопия.
- Характеристика очищенных миозинов.
- Оптимизация флуорофоров и химических условий.
- Подготовка и покрытие проточных камер для проведения экспериментов.
Основные результаты
- Протокол отличается высокой скоростью выполнения, воспроизводимостью и строгим контролем.
- Он позволяет изучать вызывающие заболевания мутации в немышечных миозинах.
- Универсальная методология, применимая к другим системам цитоскелета.
- Быстрая оптимизация для различных экспериментальных условий.
Выводы
- Понимание динамики миозина расширяет знания о клеточных процессах.
- Данный метод закладывает прочную основу для будущих исследований.
- Он поднимает важные вопросы относительно функции миозина при нормальном состоянии организма и при патологиях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный протокол позволяет количественно охарактеризовать моторику миозина на уровнях одиночных молекул и ансамблей, обеспечивая понимание механизмов функционирования моторных белков. Он способствует валидации мишеней путем установления связи между биохимическими свойствами и клеточными фенотипами, что помогает снизить риски при разработке терапевтических стратегий, направленных на миозин. Этот подход может быть адаптирован к моделям соответствующих заболеваний, облегчая доклиническую оценку динамики изоформ миозина в контролируемых условиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать механохимию миозина для выяснения его функциональной роли в клеточном транспорте и адгезии.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели скорости транслокации и длины пробега для оценки взаимодействия с мишенью.
- Прогностическая ценность: позволяет проверять гипотезы о том, как регуляторные условия или мутации изменяют поведение моторных белков, что помогает в оценке достоверности выбора мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Позволяет создавать стандартизированные анализы подвижности на основе флуоресценции, совместимые с высококонтентным имиджингом для скрининга соединений.
- Количественные данные: Предоставляет измеримые параметры, такие как скорость транслокации актина и длина пробега одной молекулы, для анализа зависимости «доза — ответ».
- Повторное использование платформы: Адаптируема к другим системам цитоскелета (например, кинезин/динеин с микротрубочками), что обеспечивает переносимость анализа между различными мишенями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Моделирование заболеваний: позволяет воссоздать клеточные условия для изучения вызывающих заболевание мутаций в немышечных миозинах на белковом уровне.
- Механистическое снижение рисков: связывает дефекты молекулярной подвижности с клеточными фенотипами, что способствует согласованию трансляционных биомаркеров.
- Преклиническая непрерывность: обеспечивает переход от валидации мишени на этапе поиска к доклинической функциональной оценке благодаря консервативному формату анализа.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в общую последовательность этапов разработки лекарственных средств — от валидации мишени до оптимизации соединений-лидеров, обеспечивая биофизическую характеристику, которая позволяет определить взаимосвязь между структурой и функцией моторных белков.
- Открывающая биология: способствует уточнению путей передачи сигнала и функциональной валидации изоформ миозина посредством прямого наблюдения за динамикой подвижности.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа для оценки влияния соединений на активность моторных белков в контролируемых условиях буфера.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения скорости и процессивности, что позволяет проводить сравнение между изоформами, мутантами или условиями обработки.
- Трансляционные исследования: связывают поведение отдельных молекул с результатами на уровне ансамбля, имеющими значение для таких клеточных функций, как цитокинез и поддержание натяжения.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для изучения различных моторных белков в разных терапевтических областях, сокращая затраты на повторную разработку методов анализа.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения неопределенности в механическом и химическом сопряжении миозина.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость и стандартизацию анализа в различных лабораториях благодаря четко определенным протоколам подготовки проточной камеры и получения изображений.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки за счет возможности раннего обнаружения мутаций, влияющих на подвижность, или регуляторных эффектов.
- Влияние на портфель разработок: Способствует приоритизации мишеней миозина с учетом рисков на основе валидированных функциональных доменов и профилей подвижности.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области очистки белков, флуоресцентной микроскопии и анализа изображений для отслеживания подвижности.
- Зависит от наличия систем TIRF- или широкопольной флуоресцентной микроскопии, а также возможностей изготовления проточных камер.
- Необходимо стандартизировать условия буфера, концентрации ATP и выбор флуорофоров для всех повторностей эксперимента.
- Требует оптимизации параметров для различных изоформ миозина в отношении поверхностной плотности, ионной силы и включения регуляторных белков.
- Ограничено необходимостью использования очищенных функциональных препаратов белков; на активность могут влиять теги, деградация или неправильный фолдинг.
