Миозин-специфические адаптации анализов подвижности на основе флуоресцентной микроскопии in vitro
February 4th, 2021
Здесь представлена процедура экспрессии и очистки миозина 5а с последующим обсуждением его характеристики с использованием как ансамблевых, так и одиночных молекулярных флуоресцентных анализов in vitro на основе микроскопии, и как эти методы могут быть модифицированы для характеристики немузкулярного миозина 2b.
Этот протокол может быть использован для характеристики динамики немуклинового миозина на уровне белка, который может информировать о подвижных свойствах, которые способствуют их роли в клетках. Это быстрый, воспроизводимый и строго контролируемый метод, который можно использовать для изучения влияния различных регуляторных условий на подвижность миозина, информируя об их клеточном поведении. Эти методы могут быть использованы для исследования того, как болезнетворные мутации в немышечные миозинах влияют на их поведение на уровне одной молекулы и ансамбля.
Общий подход его методологии может быть применен к различным другим цитоскелетным системам, таким как характеристика очищенных кинезинов и динеинов микротрубочами. Универсальность этого протокола может вызвать вопросы о том, какие флуорофоры и химические условия наиболее подходят, но метод может быть оптимизирован относительно быстро. Понимание того, как настроить и покрыть прототочные камеры, создает прочную основу, на которой можно адаптироваться к различным условиям для этих экспериментов.
Для начала приготовьте однопроцентный раствор нитроцеллюлозы в амилацетате и поместите круглую фильтровальную бумагу диаметром 125 миллиметров на дно пластины для культивирование ткани. Загрузите восемь квадратных крышек на стойку и тщательно вымойте их примерно двумя-пятью миллилитрами 200-стойкого этанола, а затем двумя-пятью миллилитрами дистиллированной воды. Затем привод крышки полностью скользит с помощью фильтро-воздушной линии или азотной линии.
Медленно пипетку 10 микролитров однопроцентного раствора нитроцеллюлозы вдоль одного края одного скольжения крышки. Размажьте его по остальной части крышки, используя сторону 200-микролитрового наконечника пипетки одним плавным движением. Затем поместите этот покровный слип на чашку для культивирование тканей нитроцеллюлозной стороной вверх.
Повторите это для оставшихся листов крышки и дайте им высохнуть. Протрите слайд микроскопа бумагой для оптической линзы, чтобы очистить от крупного мусора. Вырежьте два куска двусторонней ленты, длиной примерно два сантиметра, и поместите один кусок вдоль середины длинного края предметной области микроскопа.
Поместите второй кусок ленты примерно на два миллиметра ниже первого куска ленты так, чтобы они были параллельными, создавая проточную камеру, которая может вместить примерно 10 микролитров раствора. Осторожно приклейте одну из нитроцеллюлозных чехлов на ленту так, чтобы сторона, покрытая нитроцеллюлозой, непосредственно контактировала с лентой. Используя наконечник пипетки, осторожно нажмите на интерфейс слайд-ленты, чтобы убедиться, что крышка правильно приклеивается к слайду.
Затем отрежьте лишнюю ленту, свисающую над краем горки лезвием бритвы. Подготовьте растворы для Миозина 5а и держите их на льду. Продуть в 10 микролитрах Миозина 5а через скользящую протоковую камеру и подождать одну минуту.
Затем протоите в 10 микролитрах по одному миллиграмму на миллилитр BSA в буфере подвижности с DTT. Повторите это дважды и подождите минуту после третьей стирки. Используйте угол папиросной бумаги или фильтровальной бумаги, чтобы провести раствор через канал, аккуратно поместив угол бумаги на выход из блок-камеры.
Затем промыть 10 микролитрами мотористого буфера с помощью DTT. Пипетка черного актинового раствора с помощью одного миллилитра шприца и иглы 27-го калибра для сдвига актиновых нитей перед введением этого раствора в камеру. Добавьте черный актин в камеру в присутствии одного миллимоляра АТФ в 50 миллимолярных МБ с одним миллимолярным DTT.
Далее текут в 50 микролитрах буфера подвижности с DTT и одним миллимоляром АТФ для истощения камеры свободных актиновых нитей. Промывайте 10 микролитрами буфера подвижности с DTT три раза, чтобы истощить камеру любого АТФ. Продуть в 10 микролитрах 20 наномолярного раствора резус-актина, содержащего буфер подвижности с DTT, и подождать одну минуту, чтобы обеспечить строгое связывание актиновых нитей с миозином 5а, прикрепленным к поверхности крышки.
Промывайте 10 микролитрами 50-миллимолярного буфера подвижности с DTT дважды, чтобы удалить несвязанный RH актиновых нитей. Расход в 30 микролитрах конечного буфера. Записывайте изображения на флуоресцентный микроскоп, используя длину волны возбуждения 561 нанометр для визуализации резус-актина.
Подготовьте растворы для анализа моторики Myosin 5a и держите их на льду. Промывайте их камерой с 10 микролитрами мотористого буфера с DTT. Расход в 10 микролитрах по одному миллиграмму на миллилитр BSA в буфере подвижности с DTT.
Повторите это дважды, подождав через минуту после третьей стирки. Используйте салфетку или фильтровальную бумагу, чтобы провести раствор через канал, осторожно поместив угол бумаги на выходе из проточной камеры. Затем трижды промыть камеру 10 микролитрами буфера подвижности с помощью DTT.
Протойте в 10 микролитрах раствора NeutrAvidin в буфер подвижности с DTT и подождите одну минуту. Затем трижды промыть 10 микролитрами этого раствора. Протекать в 10 микролитрах brh актина, содержащего буфер подвижности с DTT, используя большой наконечник пипетки.
И подождите одну минуту. Затем трижды промыть 10 микролитрами буфера подвижности с помощью DTT. Поток в 30 микролитрах конечного буфера с 10 наномолярами миозина 5а.
И сразу же загрузить на полное внутреннее отражение флуоресцентного микроскопа. Начните запись, как только будет найден оптимальный фокус для визуализации TIRF. Очистка немуклинального миозина 2b, эссенциалных легких цепей и регуляторных легких цепей, а также миозина 5а и кальмодулина оценивалась путем выполнения SDS-PAGE.
Анализ скользящей актиновой нити показывает характеристики идеального и отслеживаемого фильма с плавными движениями меченых актиновых нитей. Черная актиновая промывка гарантировала, что мертвые головки миозина были удалены из поля измерения, что еще больше способствовало общему плавному движению актиновых нитей. Выходные изображения отслеживания нити из программы fast track были получены для немуклиновых Myosin 2b и Myosin 5a.
Репрезентативная гистограмма показывает, что скорость скольжения Actomyosin 2b составляет 77 нанометров в секунду. А у Actomyosin 5a — 515 нанометров в секунду. В отсутствие метилцеллюлозы актиновые нити не остаются так тесно связанными поверхностью, покрытой миозином, в результате чего она плюхает близко к поверхности немышельных покрытий, покрытых миосином 2b.
Движение миозина наблюдалось на поверхностно-привязанных флуоресцентных актиновых нитях с использованием перевернутого анализа подвижности. Важно срежевать немаркированный актин перед введением его в проточную ячейку для промывки черного актина, что позволит плавно транслокировать актин. Дополнительные эксперименты могут исследовать, как на подвижность миозина влияют мутации миозина, вызывающие нагрузку белки, ионная сила и регуляторные белки.
Различные клеточные состояния могут быть восстановлены для будущих исследований. Эти методы позволяют проводить биохимические и биофизические исследования того, как различные изоформы миозина различаются по своим подвижным и механическим свойствам на уровне одной молекулы и ансамбля.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол описывает экспрессию и очистку миозина 5а, а также его характеристику с использованием in vitro анализов флуоресцентной микроскопии. Также обсуждаются модификации для изучения немышечно-мышечного миозина 2б.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Клеточная биология
- Нейробиология
Основы
- Миозин играет ключевую роль в клеточной подвижности.
- Понимание динамики миозина необходимо для выяснения их функций в клетках.
- Немышечные миозины участвуют в различных клеточных процессах.
- Методы характеристики могут раскрыть влияние мутаций на поведение миозина.
Цель исследования
- Характеризовать динамику немышечно-мышечного миозина на уровне белка.
- Освещать подвижные свойства, способствующие клеточным ролям.
- Исследовать влияние регулирующих условий на подвижность миозина.
Использованные методы
- Комплексная и одномолекулярная флуоресцентная микроскопия.
- Характеристика очищенных миозинов.
- Оптимизация флуоресцентных меток и химических условий.
- Настройка и покрытие камер потока для экспериментов.
Основные результаты
- Протокол является быстрым, воспроизводимым и высоко контролируемым.
- Он позволяет изучать мутации, вызывающие заболевания, в немышечно-мышечных миозинах.
- Универсальная методология, применимая к другим системам цитоскелета.
- Быстрая оптимизация для различных экспериментальных условий.
Выводы
- Понимание динамики миозина улучшает знания о клеточных поведениях.
- Этот метод предоставляет прочную основу для будущих исследований.
- Это поднимает важные вопросы касательно функции миозина в здоровье и заболеваниях.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative characterization of myosin motility at single molecule and ensemble levels, providing mechanistic insights into motor protein function. It supports target validation by linking biochemical properties to cellular phenotypes, informing de-risking of myosin-directed therapeutic strategies. The approach is adaptable to disease-relevant models, facilitating preclinical evaluation of myosin isoform dynamics under controlled conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myosin mechanochemistry to clarify functional roles in cellular transport and adhesion.
- Operational Value: Provides reproducible, quantitative readouts of translocation velocity and run length for target engagement assessment.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of how regulatory conditions or mutations alter motor protein behavior, aiding in target confidence scoring.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, fluorescence-based motility assays compatible with high-content imaging for compound screening.
- Quantitative Output: Delivers measurable parameters such as actin translocation velocity and single molecule run length for dose-response analysis.
- Platform Reuse: Adaptable to other cytoskeletal systems (e.g., kinesin/dynein with microtubules), enabling cross-target assay portability.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Allows reconstitution of cellular conditions to study disease-causing mutations in non-muscle myosins at the protein level.
- Mechanistic De-risking: Links molecular motility defects to cellular phenotypes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical functional assessment through conserved assay format.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, offering biophysical characterization that informs structure-function relationships in motor proteins.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of myosin isoforms through direct observation of motility dynamics.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for evaluating compound effects on motor protein activity under controlled buffer conditions.
- Analytics: Provides quantitative measurements of velocity and processivity that allow comparison across isoforms, mutants, or treatment conditions.
- Translational Research: Connects single molecule behavior to ensemble-level outputs relevant to cellular functions like cytokinesis and tension maintenance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying diverse motor proteins across therapeutic areas, reducing assay redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in myosin mechanochemical coupling.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility and standardization across laboratories through defined flow chamber preparation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of motility-altering mutations or regulatory effects.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of myosin targets based on validated functional domains and motility profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, fluorescence microscopy, and image analysis for motility tracking.
- Depends on access to TIRF or widefield fluorescence microscopy systems and flow chamber fabrication capabilities.
- Necessitates standardization of buffer conditions, ATP concentrations, and fluorophore selection across experimental replicates.
- Involves optimization considerations for different myosin isoforms regarding surface density, ionic strength, and regulatory protein inclusion.
- Limited by the need for purified, functional protein preparations; activity may be affected by tags, degradation, or improper folding.
