Быстрая подготовка сетки для криоэлектроно-микроскопии с временным разрешением

Здравствуйте, и добро пожаловать в это видео JoVE. Мы хотим познакомить вас с установкой, которую мы здесь получили для быстрого создания сетки, исследование с временным решением, которое мы разрабатываем в Лидсе. Имейте в виду, что это не стандартная система, но мы надеемся, что, предоставив вам подробный отчет обо всех вещах и параметрах, которые мы делаем, вы сможете разрабатывать подобные системы в своих собственных лабораториях.

Подробное описание устройства приведено в Ричмондском протоколе. Здесь мы дадим пошаговое руководство по быстрой подготовке сетки и временным решениям EM. По нашему опыту, концентрация белка должна составлять два миллиграмма на миллилитр или выше. Протокол требует минимального объема около 50 микролитров.

Включите устройство. Затем включите контрольный ПК и запустите управляя программное обеспечение. Инициализируйте все шприцевые насосы, нажав кнопку инициализации на каждом шприцевом насосе.

Включите блок питания потенциометра, установите его на девять вольт и запустите программное обеспечение для управления осциллографом. Для создания распыления необходим газообразный азот под давлением. Откройте азотный цилиндр и установите давление на 2 бар.

Убедитесь, что все клапаны шприцевого насоса находятся в положении нагрузки. Для этого переключите все клапаны на дозирование в управляющий по программе, а затем обратно на загрузку. Установите все шприцы на ноль.

Любые пузырьки воздуха, присутствующие в системе, должны быть удалены на этом этапе. Для этого шприцы, возможно, придется открутить, пузырьки удалить вручную, а шприцы снова смонтировать, когда они больше не содержат пузырьков. Система обработки жидкостей обычно хранится в воде.

Перед загрузкой образца система уравновешивается буфером. Это делается путем промывки трубки с избытком буфера. Поместите на шприц-один пробирку, содержащую, по меньшей мере, 200 микролитров буфера.

Верхнюю часть трубки необходимо проткнуть, чтобы прикрепить ее. Аспирируйте подходящее количество буфера, от 50 до ста микролитров со шприцем один с помощью программного обеспечения управления. Переключать клапан один для дозирования.

Дозировать всю жидкость в шприц-один. Верните клапан один в положение нагрузки и нажмите кнопку инициализации на шприце, чтобы подготовить систему к следующему циклу промывки. Эти шаги обычно повторяют три раза, чтобы обеспечить тщательную промывку трубки.

Далее позиционируется распылительная насадка. Поместите ЭМ-сетку в погружающую руку. Расположите сетку перед распылительным соплом.

Дозируйте буфер с помощью управляющего программного обеспечения. Если насадка и сетка выровнены, жидкость должна накапливаться после распыления в течение длительного периода времени. При необходимости отрегулируйте положение сопла, а затем еще раз проверьте, где жидкость скапливается на сетке.

Затем отрегулируйте положение этановой чашки. Кончик пинцетом должен доходить примерно до центра этановой чашечки. Выполните тестовый запуск, чтобы убедиться в правильной правильной настройке.

Закройте камеру влажности. Убедитесь, что путь плунжера ясен. Аспирировать объем буфера, необходимый для одного запуска в шприц.

Переключать клапан один для дозирования. Запустите запуск, нажав run'in управляя программным обеспечением. Проверьте, что шприц-насос один движется, две секунды в этом случае, а сетка погружается после соответствующей задержки, здесь 1,5 секунды.

Когда пробег будет завершен, установите давление на плечи плунжера до нужного значения. Нажмите OK'in управляющее программное обеспечение, чтобы снять давление с погружающегося рычага. Теперь этановая чашка остыла и заполнена жидким этаном.

Тлеющий разряд сетки перед использованием. Типичный тлеющий разряд составляет 90 секунд при 10 миллиампер в воздухе 0,1 миллибара. Затем трубка уравновешивается образцом.

Если доступный объем пробы низкий, трубка может быть уравновешивается только одним мертвым объемом. Образец аспирата. Обычно мертвый объем составляет около 30 микролитров.

Переключать клапан один для дозирования. Дозирование образца через трубку и сопло. Затем аспирировать количество образца, необходимое для одного прогока.

Переключать клапан один для дозирования. Убедитесь, что относительная влажность достигла нужного значения. Обычно мы готовим сетки на 60% и выше.

Это может занять несколько минут. Поместите пинцет, держащий светящуюся сетку, в погружающую руку. Поместите слайд потенциометра в начальное положение, готовое к измерению скорости.

Установите триггер для измерения скорости в программном обеспечении осциллографа. Поместите чашку с жидким этаном и близко к камере влажности. Убедитесь, что путь плунжера ясен.

Запустите запуск в управляемом программном обеспечении. Когда запуск будет завершен, нажмите OK'in управляющее программное обеспечение, чтобы снять давление с погружающегося рычага. Откройте камеру влажности, ослабьте соединение между погружающим рычагом и пинцетем.

Подойдите вверх по погружающей руке, сохраняя сетку в жидком этане. Затем переведите сетки в жидкий азот и в хранилище. Сохраните измерение осциллографа.

Вручную сбросьте положение ползунка потенциометра и плунжера. Повторите протокол для подготовки реплицированных сеток. Эксперименты с временным разрешением проводятся аналогичным образом.

Более высокие концентрации запасов необходимы для экспериментов с временным разрешением из-за разбавления на этапе смешивания. Для эксперимента с временным разрешением используйте все три шприца. Трубка крепится к шприцевым насосам и к распылительной форсурке.

Микрофлюидная распылительная форсунок, используемая здесь, также содержит смесительный элемент. Обратите внимание, что более длинные трубки дадут больший мертвый объем, а этапы уравновешивания промывки требуют большего буфера и образца. Уравновесьте все шприцы буфером и образцом отдельно.

Как правило, шприц один используется для образца А, а шприцы два и три используются для образца B'После того, как трубка уравновешена, загрузите образец A в шприц один и образец B в шприцы два и три. Затем переключите клапаны от одного до трех для дозирования. Запустите запуск в управляемом программном обеспечении.

Обратите внимание, что для эксперимента с временным разрешением требуется другой сценарий выполнения. Различные временные задержки могут быть достигнуты двумя способами. Регулируя скорость плунжера, можно изменить временную задержку от перемешивания до замерзания.

Более высокая скорость погружения приведет к более короткой временной задержке. В качестве альтернативы, расстояние распыления этана изменяется путем регулировки вертикального положения распылительного сопла. Увеличение расстояния приведет к более длительной временной задержке.

В электронном микроскопе при низком увеличении типичная сетка выглядит так. Участки тонкого льда, как указано, подходят для сбора данных. При более высоких увеличениях частицы должны быть хорошо видны.

С тестовым образцом, таким как апоферритин, относительно небольшого набора данных из одной сетки достаточно для реконструкции с разрешением от трех до четырех ангстрем. Для экспериментов с временным разрешением мы собираем наборы данных из разных временных точек или сеток. Полезно объединить данные для 3D-классификации, а затем проследить частицы до их временных точек.

Таким образом, данные могут предоставить структурную информацию и информацию о кинетике реакции. В заключение, мы надеемся, что вам понравилось видео. Мы надеемся, что с подробными описаниями в статье JoVE вместе с видео вы сможете проводить свои собственные эксперименты с помощью быстрого создания сетки, которая, как было показано, облегчает некоторые проблемы от мутации или помогает с взаимодействиями на границе раздела воздух-вода, все, что вам нужно для проведения ваших собственных исследований с временным разрешением, чтобы попытаться поймать некоторые из этих неравновесных состояний.

Итак, счастливого создания сетки.