Двойная маркировка иммунофлуоресценции с использованием антител одного и того же вида для изучения взаимодействий хозяина и патогена
10 июля 2021 г.
Здесь протокол описывает, как выполнить двойную маркировку иммунофлуоресценции с использованием первичных антител, выращенных у одного и того же вида, для изучения взаимодействий хозяина и патогена. Кроме того, он может включать третье антитело от другого хозяина в этот протокол. Такой подход может быть выполнен в любом типе клеток и патогенов.
В этом протоколе два антитела от одного и того же хозяина могут быть использованы вместе в иммунофлуоресцентном анализе для изучения взаимодействия клеток хозяина и патогенов. Поскольку существует лишь несколько коммерческих антител, доступных для распознавания специфических клеточных структур и белков у паразитов, этот протокол может быть очень полезным. Это простой в исполнении протокол иммунофлуоресценции двойной маркировки, который использует поликлональные и моноклональные антитела, выращенные у одного и того же вида.
Многие исследователи могут не знать, что это возможно. Такой подход помогает, когда источник антител ограничен. Он может быть использован для обнаружения патогенов в белках клеток-хозяев в инфицированных клетках-хозяевах, а также может быть применен к свободным живым организмам.
Это простой протокол, требующий одного блокирующего шага между первой и второй парой антител. Процедуру продемонстрируют доктор Камила Гаше-Кастро и аспирант Лейс Траяно-Сильва из моей лаборатории. Через три дня после заражения клеток LLC-MK2 Trypanosoma cruzi, соберите супернатант из инфицированных клеток в коническую трубку 15-миллилитровой клеточной культуры.
Центрифугируйте образец, чтобы опустить клеточный мусор, затем поместите трубку при комнатной температуре, чтобы трипомастиготы переплыли к супернатанту. Через 10 минут соберите супернатант в новую коническую трубку, затем центрифугируйте образец и выбросьте супернатант перед повторным использованием гранулы, содержащей паразитов, в полной среде RPMI. Добавьте ячейки LLC-MK2 в 24-луночные пластины, содержащие УФ-стерилизованные округлые крышки, и дайте &m осесть в течение 16 часов.
Затем, чтобы заразить клетки, добавляют в каждую лунку супернатант, содержащий T.Cruzi, и инкубируют в течение шести часов. Затем промыть крышки, содержащие инфицированные и неинфицированные клетки, пять раз PBS, затем зафиксировать клетки 2% параформальдегидом в PBS. Через 10 минут промыть крышки три раза в течение пяти минут каждая с PBS, а затем пропитать крышки неионным моющим средством в течение 10 минут.
После трех пятиминутных промываний PBS инкубируйте крышки в блокирующем растворе в течение 30 минут, а затем еще одну 30-минутную инкубацию с моноклональным или поликлональным антителом мыши. После промывки PBS инкубируют покровы в течение 30 минут с вторичным антителом в блокирующем растворе и фаллоидином для окрашивания актиновых нитей в клетке-хозяине. Затем трижды промойте обшивки PBS, прежде чем наносить небольшое количество анти-выцветающего монтажного реагента со средой DAPI на поверхность слайда.
Используя щипцы, осторожно наклоните крышку в среде, чтобы предотвратить образование пузырьков. Для двойной маркировки, после инкубации покровных пластинок в блокирующем растворе, как показано ранее, инкубируют их в мышином поликлональном антителе в течение 30 минут. Затем промывайте крышки три раза в течение пяти минут каждый PBS, прежде чем инкубировать их с вторичным антителом в течение 30 минут.
Затем, после трех промывок PBS, выполните второй блокирующий этап с помощью антимышечного антимышечного IgG AffiniPure, разбавленного в блокирующем растворе. Через 30 минут снова промойте обтекатели PBS, прежде чем инкубировать их с моноклональным антителом мыши в течение еще 30 минут. Далее, после трех промывок PBS, инкубируйте крышки с козьим антимышьим антителом IgG 2B и фаллоидином.
Затем, после трех промывок PBS, нанесите анти-затухающий монтажный реагент, как показано ранее. Для тройной маркировки, после блокировки покровов и инкубации с мышиным поликлональным антителом, за которым следует козье антимышье антитело, начинают новую инкубацию с кроличьим поликлональным антителом в блокирующем растворе в течение 30 минут. Затем, после трех промывок PBS, инкубируйте покровы с антителами против козьего анти-кролика в течение 30 минут.
Затем, после трех промывок PBS, выполните блокирующий этап с анти-мышиным антителом AffiniPure против мыши, разбавленным в блокирующем растворе в течение 30 минут. Затем снова промыть обшивки перед инкубацией с любым мышиным моноклональным антителом подкласса IgG в течение 30 минут. После трех промывок PBS инкубируйте крышки в течение 30 минут со специфической парой анти-мышиных антител подкласса IgG.
После инкубации промыть крышки три раза в течение пяти минут каждый с PBS. Анализируйте иммунофлуоресцентные образцы с помощью конфокального микроскопа с 63-кратным масляным погружным объективом и обнаруживайте флуоресценцию с помощью фотоумножителя и гибридного детектора. Затем получите все конфокальные изображения с разделенными каналами и выполните обработку изображений с помощью Adobe Photoshop.
Эти изображения конфокальной микроскопии показывают результаты контрольных экспериментов инфицированных и неинфицированных клеток, подчеркивающих специфичность антител в клетке-хозяине и интернализованном паразите. Мышиное поликлональное антитело против Trypanosoma cruzi FAZ распознало гигантский белок T.cruzi в зоне прикрепления жгутика в жгутике паразита, но не в клетке-хозяине. Распределение гетерогенного ядерного рибонуклеопротеина А1 в ядрах наблюдалось с использованием коммерческого мышиного моноклонального антитела, которое распознает только клетки млекопитающих-хозяев, но не паразита.
Кроме того, ядра хозяина и паразита и паразита кинетопласты были окрашены DAPI, а F-актин хозяина был окрашен фаллоидином, конъюгированным с Alexa 594, подтверждая специфичность антител. Двойная маркировка иммунофлуоресценции показывает распределение белка в хозяине и паразите, проанализированное с помощью конфокальной микроскопии. Маркировка не предполагала перекрестной реакции между антителами с использованием этой методологии.
Таким образом, протокол, описанный здесь для изучения взаимодействий хозяина и патогена, представляет собой базовую и сложную технику, которая может быть адаптирована к любой комбинации антител. Этот подход делает иммунофлуоресценцию экономически эффективной и может помочь изучить локализацию двух или более белков, представляющих интерес, когда доступно мало антител.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол проведения двойного и тройного иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием поликлональных и моноклональных антител, полученных у одного и того же вида животных. Этот метод особенно ценен для изучения взаимодействий между клетками хозяина и патогеном, особенно в случаях, когда коммерческие антитела к специфическим белкам паразитов ограничены или недоступны. Протокол продемонстрирован на примере клеток LLC-MK2, инфицированных Trypanosoma cruzi, и содержит стратегии по предотвращению перекрестной реактивности антител.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Иммунофлуоресцентная микроскопия
- Паразитология
Теоретические основы
- Коммерческие антитела к белкам паразитов встречаются редко, особенно для трипаносоматид.
- Поликлональные антитела часто готовятся внутри лаборатории, что может осложнить мультиплексное мечение, если антитела получены от одного и того же вида животных.
- Двойное или тройное мечение необходимо для визуализации нескольких белков или структур в системах хозяин-патоген.
- Предотвращение перекрестной реактивности между антителами одного вида представляет собой сложную техническую задачу.
Цель исследования
- Продемонстрировать протокол, позволяющий использовать два или более антитела от одного и того же вида хозяина в анализах методом иммунофлуоресценции.
- Облегчить изучение взаимодействий между хозяином и патогеном в условиях ограниченных ресурсов антител.
- Представить экономически эффективный и адаптируемый метод для исследования локализации белков в инфицированных клетках.
Используемые методы
- Инфицирование клеток LLC-MK2 Trypanosoma cruzi и подготовка инфицированных образцов.
- Последовательная инкубация с поликлональными и моноклональными антителами мыши, разделенная критическим этапом блокировки с использованием AffiniPure кроличьих антител к IgG мыши.
- Использование вторичных антител, конъюгированных с различными флуорохромами, для дифференцированного мечения.
- Тройное мечение путем введения третьего антитела от другого вида (например, кролика) с соответствующими вторичными антителами и этапами блокировки.
- Окрашивание ядер DAPI и актиновых филаментов фаллоидином-Alexa 594.
- Конфокальная микроскопия для визуализации и анализа меченных образцов.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет успешно проводить двойное и тройное мечение без перекрестной реактивности между антителами одного вида.
- Была достигнута специфическая локализация белков паразита и хозяина: антитела к FAZ T. cruzi метили зону прикрепления жгутика паразита, в то время как антитела к hnRNP A1 метили только ядра клеток хозяина.
- Окрашивание DAPI и фаллоидином подтвердило специфичность и целостность мечения.
- Конфокальные изображения продемонстрировали четкое различие между структурами хозяина и паразита, что подтверждает эффективность метода.
Выводы
- Данный протокол обеспечивает гибкое и надежное иммунофлуоресцентное мечение в условиях ограниченного количества антител.
- Метод применим к различным типам клеток и комбинациям антител.
- Он представляет собой экономически эффективное решение для изучения локализации белков в системах «хозяин-патоген».
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием антител из одного вида решает критическую проблему в исследованиях взаимодействия хозяина и патогена, когда доступность коммерческих антител ограничена, особенно для мишеней-паразитов. Данный протокол позволяет проводить мультиплексную локализацию белков в инфицированных клетках, что способствует механистическому снижению рисков и валидации мишеней на ранних этапах разработки. Его адаптивность и экономическая эффективность делают его ценным инструментом для биофармацевтических групп, работающих с редкими или собственными ресурсами антител.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать взаимодействия между хозяином и патогеном в условиях дефицита коммерческих антител.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней за счет возможности одновременного детектирования белков хозяина и патогена.
- Способствует снижению механистических рисков путем уточнения локализации белков в сложных моделях инфекции.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные биологические системы для последующих рабочих процессов скрининга за счет обеспечения возможности мультиплексного мечения.
- Повышает воспроизводимость и стандартизацию анализа благодаря определенным этапам блокировки и детекции.
- Обеспечивает получение надежных количественных данных визуализации для оценки соединений в моделях инфекции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует системам, имеющим значение для изучения заболеваний, обеспечивая возможность исследования локализации белков в инфицированных клетках хозяина.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет поддержки гибких комбинаций антител.
- Снижает биологические риски в трансляционных исследованиях, где ресурсы антител ограничены.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол интегрируется в процесс исследований — от ранних механистических исследований до валидации на доклинических моделях, особенно в тех случаях, когда доступ к антителам ограничен.
- Поисковая биология: поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей в системах «хозяин-патоген».
- Скрининг: обеспечивает готовность к проведению воспроизводимых мультиплексных анализов для моделей инфекции.
- Аналитика: предоставляет количественные данные визуализации с разделением по каналам для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: обеспечивают согласованность биомаркеров и преемственность в релевантных моделях инфекционных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: предлагает воспроизводимый рабочий процесс, адаптируемый к различным типам клеток и источникам антител.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в исследованиях взаимодействия хозяина и патогена.
- Операционная ценность: Стандартизирует мультиплексную иммунофлуоресценцию при ограниченных ресурсах антител.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) за счет обеспечения надежной валидации мишеней в сложных системах.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию с учетом рисков в случаях, когда коммерческие реагенты недоступны.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с иммунофлуоресценцией и конфокальной микроскопией.
- Необходим доступ к высококачественной инфраструктуре для получения изображений и валидированным вторичным антителам.
- Требуется строгое соблюдение этапов блокировки и промывки для предотвращения перекрестной реактивности.
- Метод может быть адаптирован для различных типов клеток и моделей инфекции при ограниченном выборе антител.
- Результат зависит от тщательного подбора антител и совместимости их подклассов для мультиплексного анализа.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:21
Parasite Cultures
2:00
Control Immunofluorescence Protocol
3:23
Double Labeling Immunofluorescence ProtocolUsing Monoclonal and Polyclonal Antibodies Raised in the Same Host
4:18
Triple Labeling Immunofluorescence Protocol with the Addition of the Third Polyclonal Antibody from Different Host Species
5:16
Confocal Imaging Acquisition
5:39
Results: Host-pathogen Interactions Studies Using Double Labeling Immunofluorescence
6:51
Conclusion
