Прижизненная многофотонная микроскопия в режиме реального времени для визуализации сфокусированного ультразвука и микропузырьковых процедур для повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера

Ультразвуковое воздействие при наличии микропузырьков стало эффективным методом преходящего и локального повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера. Обычно гематоэнцефалический барьер препятствует доставке потенциальных лекарств для лечения нескольких заболеваний головного мозга. После обработки ультразвуком введенные микропузырьки начинают колебаться и вызывают напряжение на стенке сосуда, открывая плотные соединения и в конечном итоге позволяя лекарствам пересекать гематоэнцефалический барьер В доклинических моделях эффект ультразвука и лечения микропузырьками часто изучается с помощью магнитно-резонансной томографии с контрастным усилением или путем изучения экстравазации красителей ex vivo.

Недостатком такого подхода является то, что реакция в реальном времени во время и сразу после ультразвукового воздействия не может быть получена. Прижизненная многофотонная визуализация головного мозга дает возможность изучать эти эффекты в режиме реального времени. В следующем видео мы представим пошаговую инструкцию о том, как поместить краниальное окно в мышь и выполнить ультразвуковую обработку микропузырем с помощью кольцевого преобразователя, установленного на черепе.

Эта процедура обеспечивает одновременную обработку ультразвуком и многофотонную визуализацию in vivo. Для начала необходимо подготовить материалы, необходимые для хирургии черепного окна и ультразвуковой обработки микропузырьков. В этом видео мы показываем острую невосстанавливающую операцию на черепном окне.

Для хронического восстановления хирургии черепных окон необходимы стерилизованные инструменты и материалы, стерильное хирургическое пространство и соответствующие препараты. Перед операцией вводят анестезию и обезболивание. Снимите мех на голове.

Поместите животное в стереотаксическую рамку. Вставьте катетер в заднюю вену для инъекций декстрана и микропузырьков. Поддерживайте температуру ядра животного 37 градусов с помощью источника тепла.

Здесь мы используем перчатку, наполненную теплой водой. Чтобы удалить кожу головы, поднимите кожу между глазами с помощью щипцов и разрезайте вдоль сагиттального шва. Удалите надкостницу, покрывающую внешнюю поверхность черепа ватным тампоном.

После этого отметьте нужное расположение краниального окна на черепе и приступайте к сверлению вдоль контура. Чтобы предотвратить перегрев черепа во время сверления, капните физиологический раствор на череп с помощью шприца или нанесите кусок хирургической губки, смоченный в физиологическом растворе. Чередуйте сверление и охлаждение черепа.

Проверьте ход бурения, оказав мягкое давление на костный остров. Удалите костный остров с помощью пары щипцов. Убедитесь, что мозг остается влажным, используя кусок хирургической губки, который был предварительно пропитан физиологическим раствором.

Чтобы поместить краниальное окно, поместите каплю физиологического раствора на одну сторону крышки и маневрируйте ею над отверстием в черепе. Распределите слой клея по периметру чехлового листа, чтобы прикрепить его к черепу. Как только клей полностью высохнет, нанесите раствор агарозы на окно и поместите датчик сверху.

Примените сильное давление таким образом, чтобы между датчиком и краниальным окном была минимальная агароза. Когда агароза остынет до желеобразной консистенции, отрежьте избыток агарозы с окружностей крышки преобразователя. Распределите слой клея по окружности чехла преобразователя, чтобы приклеить его к черепу.

После того, как клей полностью высохнет, поместите животное под объектив микроскопа. Убедитесь, что объектив не сталкивается с датчиком или крышкой. Выберите поле зрения в многофотонном микроскопе.

Настройте сканирование сосудистой системы и начните обработку ультразвуком. Для этого протокола мы используем кольцевой преобразователь, который работает на частоте движения 0,82 мегагерца, 10-миллисекундных циклах, механически индексированных от 0,2 до 0,4, и частотах повторения импульсов от одного до четырех Герц. Микропузырьки Sonovue вводят в дозе один миллилитр на килограмм.

Успешные ультразвуковые микропузырьковые процедуры могут быть обнаружены по экстравазации флуоресцентного декстрана из внутрисосудистого во внесосудистое пространство, что указывает на увеличение проницаемости ГЭБ. Для оценки кинетики утечки декстрана в качестве репрезентативной модели доставки лекарственного средства интенсивность сигнала между внутрисосудистым и внесосудистым пространствами может быть оценена с использованием таких инструментов, как MATLAB. Чтобы оценить сосудистые изменения, вызванные ультразвуковыми микропузырьками, диаметр интересующего сосуда может быть измерен до, во время и после ультразвуковой обработки микропузырьками.

Анализ изображений может проводиться с помощью программного обеспечения, такого как ImageJ, FIJI, или инструментов программирования. Здесь имарис использовался для сегментации и классификации кровеносных сосудов. Прижизненная многофотонная микроскопия головного мозга в сочетании с кольцевыми преобразователями обеспечивает метод мониторинга эффектов, индуцированных ультразвуковым микропузырьковым лечением, в режиме реального времени с высоким пространственным и временным разрешением.

Количественные и качественные данные могут быть получены для изучения, например, кинетики экстравазации и сосудистых изменений. Экспериментальный метод, представленный здесь, может быть применен к нескольким моделям исследований и к различным ультразвуковым приложениям.