Высокопроизводительный анализ транскриптома для исследования взаимодействий хозяина и патогена
5 марта 2022 г.
Протокол, представленный здесь, описывает полный конвейер для анализа данных транскриптома РНК-секвенирования от необработанных считываний до функционального анализа, включая контроль качества и этапы предварительной обработки для передовых статистических аналитических подходов.
Добро пожаловать в протокол высокопроизводительного анализа транскриптома для исследования взаимодействий хозяин-патоген. Этот протокол разделен на следующие шаги. Контроль качества для фильтрации низкокачественных считываний, а также для удаления последовательностей адаптера Секвенирование и аннотации, где вы должны сопоставить чтения в эталонные геномы и аннотировать считывания в гены.
Статистический и коэкспрессионный анализ, который определяет дифференциально экспрессируемые гены, а также находит модули коэкспрессии. Анализ молекулярной степени возмущения для поиска потенциальных образцов выброса. И, наконец, функциональный анализ для определения биологических функций дифференциально экспрессированных генов.
Все инструменты, использующие эти конвейеры, были предварительно установлены в системе Linux и инкапсулированы в контейнер Docker. Образцы, использующие эти протоколы, получены из статьи, опубликованной нашей группой в PLOS Pathogen. Образцы включают 20 здоровых людей и 39 пациентов, инфицированных вирусом чикунгунья.
Были собраны образцы крови и проведено секвенирование РНК. Чтобы установить Docker в системе Windows, необходимо выполнить следующие действия. Перейдите на официальную веб-страницу Docker и нажмите кнопку Начало работы.
Найдите установщик Docker Desktop для Windows. Загрузите файл. Установите локально на компьютере.
Убедитесь, что эти два параметра отмечены. После установки программы загружается образ Docker для этого протокола. Перейдите в терминал Windows.
Выполните команды для загрузки образа. После загрузки образа вы можете увидеть файл на рабочем столе Docker, и из этого образа мы можем инициировать контейнер. После нажатия круглой кнопки необходимо развернуть исходные параметры и параметры, чтобы определить имя контейнера и связать папку на локальном компьютере с папкой внутри Docker.
После этого щелкните Выполнить, чтобы запустить контейнер. Затем вы можете получить доступ к терминалу, который находится в системе Linux внутри Docker. Введите команды bash, после чего можно будет выполнить все команды этого протокола.
Во-первых, мы должны выполнить исходный код, чтобы сделать все инструменты этого протокола доступными. Вы должны получить доступ к сценариям каталога. Чтобы выполнить транскриптомный анализ, вы должны сначала загрузить эталонный геном.
Для этого необходимо выполнить следующие команды. После загрузки генома вы должны загрузить аннотацию генов. Для этого необходимо ввести следующие команды.
Далее вам предстоит настроить fastq-дамп. Это позволяет загружать файлы виртуализации примеров. После ввода следующих команд необходимо использовать кнопку Tab, чтобы перейти к опции Сервис и пометить каталог текущих параметров.
Используйте кнопки Tab для сохранения, а затем ОК. А затем выйдите из инструмента fastq-dump. Теперь мы можем инициировать загрузку чтения, введя следующие команды.
Контроль качества состоит и оценивает графически вероятность ошибок в последовательности чтения. На этом шаге также необходимо удалить технические последовательности, такие как адаптеры. Чтобы сгенерировать графики контроля качества, необходимо запустить программу FastQC.
Чтобы удалить последовательности адаптера и последовательности низкого качества, необходимо ввести следующие команды. С хорошим качеством чтения мы должны теперь сопоставить чтения в эталонном геноме. После картирования нам придется аннотировать гены в соответствии с человеческими генами, а затем подсчитать количество считываний, которые соответствуют каждому человеческому гену.
Первым шагом является индексация эталонного генома путем ввода следующей команды. Затем мы вводим эту команду, чтобы сопоставить показания в геноме человека. Затем следует запустить сценарии, которые аннотируют чтение.
После картирования и аннотации можно выполнить дифференциальный экспресс-анализ, который заключается в нахождении генов, экспрессия которых выше или ниже в одной группе по сравнению с другой. Чтобы идентифицировать дифференциально экспрессированные гены, или DEG, необходимо выполнить следующие команды. После этого можно перенести результаты обработки данных из Docker на локальный компьютер.
Для этого зайдите в терминал и введите следующие команды, чтобы сохранить все результаты в локальную папку. Для выполнения оставшегося анализа необходимо также скопировать все файлы данных каталога в каталог на локальном компьютере. На локальном компьютере вы сможете увидеть каталоги, в которых вы сохранили данные из Docker.
Как видите, вы можете получить доступ ко всем библиотекам. Можно также открыть HTML-файл, содержащий отчеты о контроле качества. Вы также можете получить доступ к каталогу, содержащему дифференциально экспрессированные гены.
И внутри этого каталога вы найдете графики вулканов, где вы можете увидеть гены, которые регулируются вверх или вниз в одной группе по сравнению с другой, в данном случае пациенты, инфицированные вирусом чикунгуньи, по сравнению со здоровыми контрольными группами. Все остальные шаги этого протокола будут выполняться в веб-инструментах с помощью вашего браузера. Давайте начнем с CEMiTool.
Зайдите в браузер и введите следующий адрес. CEMiTool идентифицирует модули совместного выражения из наборов данных выражений, предоставляемых пользователями. На главной странице можно зайти в меню и нажать на кнопку Выполнить.
Откроется новая страница, на которую можно загрузить файл выражения. Этот файл находится в каталоге локального компьютера. Вы увидите, что есть три файла выражений, и тот, который мы собираемся использовать для CEMiTool, является вызовом нормализации tmm.
Затем вы должны выбрать файл фенодат, то же самое для файла, содержащего белково-белковые взаимодействия, и, наконец, загрузить файл, содержащий наборы генов или пути. Файл наборов генов позволяет CEMiTool выполнять анализ обогащения для каждого модуля коэкспрессии. Далее необходимо развернуть раздел параметров и щелкнуть в поле Применить VST.
После этого вы можете просто нажать Запустить CEMiTool. После запуска CEMiTool вы увидите, что было идентифицировано 12 модулей совместного выражения. Нажав здесь, вы можете скачать все результаты этого анализа.
Другим инструментом, который мы собираемся использовать в этом протоколе, является MDP, или молекулярная степень возмущения. Просто введите в браузере mdp.sysbio.tools. MDP вычисляет молекулярное расстояние каждого образца по сравнению с референтной группой образцов, в данном случае здоровыми контрольными группами, чтобы найти не только потенциальные выбросы, но и то, насколько возмущены каждый образец по сравнению с этой группой.
На странице Выполнить можно просто загрузить файл выражения, нажав кнопку и выбрав файл. Затем вы должны загрузить файл phenodata. Затем необходимо определить, какой столбец содержит сведения о группе или классе, а затем какой класс или группа соответствуют контрольной группе.
После этого вы можете просто запустить MDP. Гистограмма показывает для каждого из образцов в виде бара оценку молекулярной степени возмущения, а цвета представляют различные группы. И прямоугольный график - это еще один способ визуализации тех же результатов, где вы видите на каждой точке разные образцы, разделенные двумя группами.
Для выполнения функционального анализа мы будем использовать инструмент Enrichr. Для этого вы должны выбрать список генов, которые были дифференциально экспрессированы, либо вверх, либо вниз, и использовать его в качестве входного списка генов в инструменте Enrichr. Вы увидите, что есть разные вкладки.
Все результаты также можно загрузить на локальный компьютер. Компьютерная среда для анализа транскриптома была размещена на платформе Docker. Такой подход позволяет пользователям, не имеющим опыта работы с системой Linux, использовать терминал.
В этом контейнере есть предопределенная структура папок для набора данных и скриптов, которые необходимы для всего анализа. В процессе разработки пользователи будут использовать данные транскриптома крови от 20 здоровых людей и 39 пациентов, остро инфицированных вирусом чикунгуньи. Платформа секвенирования возвращает набор файлов FASTQ, содержащих последовательность ДНК, т.е.
показания и связанное с ними качество для каждого нуклеотидного основания. Шкала качества Phred указывает на вероятность неправильного считывания для каждой базы. Инструменты выявляют и удаляют некачественные считываемые данные из образцов и повышают вероятность сопоставления считываний.
На этом этапе модуль картирования, восстановленные высококачественные считывания используются в качестве входных данных для выравнивания их с эталонным геномом человека. CEMiTool идентифицирует и анализирует модули совместного выражения. Гены в одном модуле совместно экспрессируются, что означает, что они демонстрируют сходные паттерны экспрессии в выборках наборов данных.
Сетевой анализ предоставляет информацию о наиболее связанных генах, т.е. хабах. Названия этих генов показаны в сети.
Размер узлов пропорционален степени его связности. Результаты, полученные в результате анализа DEG, были обобщены на участках вулканов. Анализ молекулярной степени возмущения позволяет идентифицировать возмущенные образцы от здоровых и инфицированных людей.
MDP предполагает, какие образцы являются потенциальными биологическими выбросами. Удаление этих образцов повлияет на последующие результаты. Анализ функционального обогащения с использованием AURA может быть выполнен с помощью инструмента Enrichr.
Эти шаги помогают интерпретировать результаты, выявляя общие функциональные роли нескольких генов, которые были дифференциально экспрессированы. Биологический процесс, показанный на гистограммах, представляет собой топ-10 обогащенных наборов генов, основанных на их рейтинге p-значения. В заключение, эти протоколы охватывают все этапы анализа RNA-Seq.
Трубопровод был разработан и инкапсулирован в некоммерческую систему под названием Docker. На изображении и сделано доступным для научного сообщества. Из-за контейнерной системы все скрипты и инструменты находятся под одной и той же конкретной версией, чтобы гарантировать воспроизводимость.
Кроме того, часть анализа биоинформатики была выполнена с помощью бесплатных удобных веб-инструментов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол высокопроизводительного анализа транскриптома для исследования взаимодействий между хозяином и патогеном, в частности, с использованием данных секвенирования РНК (RNA-seq). Конвейер обработки данных ведет исследователя от необработанных чтений секвенирования через контроль качества, картирование, статистический анализ и функциональную интерпретацию, используя как инструменты командной строки, так и удобные веб-инструменты, заключенные в Docker-контейнер для обеспечения воспроизводимости и доступности.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Транскриптомика
- Биоинформатика
- Взаимодействие хозяина и патогена
- Исследование инфекционных заболеваний
Теоретические основы
- Патогены вызывают различные ответные реакции хозяина, которые влияют на тяжесть заболевания.
- RNA-seq позволяет измерять динамические транскриптомные изменения в процессе инфекции.
- Анализ этих изменений может выявить механизмы развития заболевания и потенциальные терапевтические мишени.
- Стандартизированные, воспроизводимые конвейеры обработки данных необходимы для надежного анализа данных RNA-seq.
Цель исследования
- Представить пошаговый протокол анализа данных RNA-seq в исследованиях взаимодействия хозяина и патогена.
- Обеспечить воспроизводимость и доступность с помощью сред на базе Docker.
- Продемонстрировать работу конвейера обработки данных на примере образцов крови здоровых людей и пациентов, инфицированных вирусом Чикунгунья.
Используемые методы
- Контроль качества чтений секвенирования (удаление низкокачественных чтений и адаптеров с помощью FastQC и соответствующих инструментов).
- Картирование чтений на референсный геном человека и аннотация генов.
- Анализ дифференциальной экспрессии и ко-экспрессии (идентификация дифференциально экспрессируемых генов (DEGs) и модулей ко-экспрессии с помощью CEMiTool).
- Анализ молекулярной степени возмущения (MDP) для выявления выбросов и измененных образцов.
- Анализ функционального обогащения дифференциально экспрессируемых генов с помощью Enrichr.
- Инкапсуляция всех инструментов и скриптов в контейнере Docker для обеспечения воспроизводимости.
Основные результаты
- Успешная обработка данных RNA-seq от 20 здоровых контрольных образцов и 39 пациентов с инфекцией вирусом Чикунгунья.
- Идентификация дифференциально экспрессируемых генов и модулей коэкспрессии, связанных с инфекцией.
- Выявление выбросов и сильно подверженных воздействию образцов с помощью анализа MDP.
- Функциональное обогащение выявило ключевые биологические пути, связанные с фенотипом заболевания.
- Конвейер обработки данных продемонстрировал простоту использования для исследователей с ограниченным опытом работы в Linux благодаря Docker и веб-инструментам.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный и воспроизводимый рабочий процесс для анализа RNA-seq в исследованиях взаимодействий «хозяин — патоген».
- Инкапсуляция в Docker обеспечивает согласованность версий инструментов и доступность среды.
- Этот подход облегчает выявление молекулярных механизмов, лежащих в основе инфекционных заболеваний, и служит опорой для будущих экспериментальных исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Высокопроизводительный анализ транскриптома позволяет биофармацевтическим группам систематически исследовать взаимодействия между хозяином и патогеном, что способствует раннему выявлению механизмов заболевания и потенциальных терапевтических мишеней. Данный рабочий процесс обеспечивает воспроизводимые количественные данные о динамике экспрессии генов, что напрямую влияет на валидацию мишеней и принятие решений по формированию портфеля с учетом рисков. Интеграция надежных протоколов RNA-seq на этапе поиска повышает прогностическую точность и обеспечивает трансляционную преемственность в программах по изучению инфекционных заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить комплексный анализ путей иммунного ответа хозяина в процессе инфекции.
- Помогает в идентификации и приоритизации потенциальных мишеней на основе дифференциальной экспрессии генов.
- Способствует снижению механистических рисков за счет выявления модулей коэкспрессии и взаимосвязей между путями.
- Предоставляет количественные данные для валидации и отбора мишеней на основе выдвинутых гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированные транскриптомные сигнатуры для последующей разработки анализов.
- Стандартизирует качество данных и воспроизводимость за счет использования контейнеризированных рабочих процессов.
- Формирует количественные результаты, подходящие для скрининга и сравнительного анализа.
- Обеспечивает масштабируемую, платформенно-независимую интеграцию в более широкие конвейеры скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет транскриптомные данные с путями, имеющими значение для заболевания, и биомаркерами.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации путем установления связи между экспрессией генов и функциональными результатами.
- Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении на основе профилей молекулярных нарушений.
- Повышает прогностическую ценность трансляционных исследований на моделях инфекционных заболеваний.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный конвейер RNA-seq охватывает этапы от первичного поиска до доклинических исследований, объединяя контроль качества, картирование, статистический анализ и функциональную интерпретацию в воспроизводимой среде Docker.
- Открывающая биология: обеспечивает надежную проверку гипотез и уточнение сигнальных путей с помощью анализа дифференциальной и ко-экспрессии.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные, воспроизводимые транскриптомные данные для оценки готовности анализа и тестирования соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные результаты, график «вулкан» (volcano plot) и показатели молекулярных пертурбаций для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает изменения в экспрессии генов с путями, имеющими значение для заболевания, поддерживая подбор биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: предлагает контейнеризированный рабочий процесс с контролем версий для единообразного применения в различных проектах и командах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает неопределенность механизмов при выборе мишени.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость, стандартизацию и масштабируемость за счет развертывания на базе Docker.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала, основываясь на количественных транскриптомных данных.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков и передачу знаний между различными программами.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области транскриптомики, биоинформатики и статистического анализа.
- Необходим доступ к платформам секвенирования, вычислительной инфраструктуре и системам, совместимым с Docker.
- Требуется межкомандная стандартизация форматов данных и параметров анализа.
- Метод adaptable к различным моделям «хозяин-патоген» при наличии соответствующих референсных геномов и файлов аннотации.
- Оптимальные конечные результаты зависят от качества исходных образцов и данных секвенирования.
