Стратегии оптимизации сбора данных криогенной электронной томографии
March 19th, 2021
Растущий спрос на крупномасштабный сбор данных в криогенной электронной томографии требует высокопроизводительных процедур получения изображений. Здесь описан протокол, который реализует последние разработки передовых стратегий сбора, направленных на максимизацию эффективности времени и пропускной способности сбора томографических данных.
Настройка крупномасштабного сеанса сбора данных является трудоемкой процедурой, которая может значительно сократить оставшееся время микроскопа, доступное для получения серии наклона. Этот метод позволяет быстро настроить крупномасштабный автоматизированный сбор данных томографии для максимизации эффективности времени томографических экспериментов, требующих тщательного выбора целей сбора. Начните с открытия фиктивного экземпляра SerialEM.
После того, как первый квадрат сетки сопоставлен, используйте пункт меню навигатора SerialEM, чтобы увидеть монтаж в фиктивном экземпляре SerialEM. Дважды щелкните окно навигатора, чтобы открыть квадратную карту сетки. Выполните поиск по карте и воспользуйтесь фиктивной опцией навигатора SerialEM, чтобы добавить точки получения изображений на интересуемую цель.
После сопоставления новых квадратов сохраните файл навигатора и снова объедините навигатор. Продолжайте до тех пор, пока не будут сопоставлены все квадраты сетки. Снова объедините файл навигации с фиктивным экземпляром SerialEM.
Запустите скрипт виртуальных карт Pi EM из фиктивного меню SerialEM. Выберите инструменты и выберите виртуальные якорные карты. Это может занять некоторое время в зависимости от размера и количества квадратных карт сетки, а также от биннинга карт просмотра и предварительного просмотра.
Чтобы обеспечить надлежащую производительность микроскопа, используйте ту же настройку увеличения и размера пучка для сбора данных в следующем порядке. Выполните выравнивание SerialEM без комы с помощью CTF. Вставьте и центрите объективную диафрагму.
Запустите SerialEM корректный астигматизм с помощью CTF и GIF быстрой настройки. В SerialEM откройте новый файл навигатора. Считаем все точки А.
Выберите первый вид карт. Выберите свернуть. Дважды нажмите A и сверните сворачивание.
Выберите первую позицию карты. Нажмите Shift T, затем выберите самую последнюю позицию карты и нажмите Shift T еще раз. Выберите однорамочные изображения в свойствах файла, чтобы открыть диалоговое окно.
В следующем диалоговом окне свойств файла выберите нужные параметры в соответствии с потребностями в создании изображений и настройкой прибора. При появлении запроса дайте имя с номером и нажмите «Сохранить». Настройте контроллер серии наклона для первого положения TS.
По завершении нажмите кнопку ОК, чтобы задать эти параметры для всех серий наклонов после этого элемента сбора. Все карты предварительного просмотра теперь выбираются как TS с пронумерованным именем файла. При необходимости установите расстояние фокусировки/трека для каждой цели.
Дважды щелкните на карте просмотра, чтобы загрузить ее. Выберите карту предварительного просмотра в списке навигатора. Затем выберите «Редактировать фокус» в окне навигатора.
На панели управления низкой дозой откажитесь от выбора, поверните межосевую ось, чтобы расположить испытание и сфокусироваться вдоль оси наклона ступени. Щелкните нужную область на загруженной карте просмотра, чтобы установить пробное положение фокуса для этой серии наклонов и убедиться, что элемент навигатора имеет TSP. Повторите процедуру для всех элементов.
Отредактируйте диапазон фокусировки в скрипте PreTomo, который запускается перед каждым рядом наклона. В меню SerialEM tilt series проверьте сценарий запуска в TS и выберите номер сценария DuringTomo во время каждого наклона. Проверьте уровень азотного бака и то, выбран ли турбонаддув автозагрузчика.
Проверьте свободное место в хранилище данных. В меню Файл SerialEM сняте выбор параметра Непрерывное сохранение файла журнала. Каждая серия наклонов получит свой собственный файл журнала.
После нажатия на приобретаемые элементы в навигационном меню, запустите скрипт PreTomo. Выберите основную задачу получения серии наклонов, затем выберите запустить сценарий после PostTomo. Выберите закрыть клапаны столбцов в конце и отправьте электронное письмо в конце, затем нажмите «Перейти».
71 подходящий квадрат был выбран на карте сетки при меньшем увеличении. Были получены карты среднего увеличения с настройками, которые позволяют напрямую визуализировать и идентифицировать интересующий образец, в данном случае коронавирусов. Время приобретения составило три минуты на квадрат, в общей сложности три часа и 45 минут.
Когда была создана первая квадратная карта, на отдельном компьютере был открыт фиктивный экземпляр SerialEM для визуализации квадратной карты и добавления точек на мишенях, подходящих для получения серии наклона. Была настроена низкая доза SerialEM, а изображения с контрольным видом и предварительным просмотром были взяты и сохранены в виде карт. Последние карты затем могут быть немедленно использованы на фиктивном экземпляре SerialEM для создания виртуального представления и виртуального предварительного просмотра из соответствующих квадратных изображений карты.
Карты виртуального вида использовались для первоначального центрирования цели, за которым последовало окончательное центрирование, выполненное при фактическом увеличении сбора серии наклона с использованием виртуальной карты предварительного просмотра. Пользователи должны предоставить себе достаточно времени для изучения ландшафта образцов. После поиска на некоторых картах вы лучше чувствуете области хорошего качества для сбора данных.
Обзор
В этой статье представлен протокол, разработанный для повышения эффективности криогенной электронной томографии, учитывающий необходимость сбора данных в больших масштабах. Метод направлен на оптимизацию установки для визуализации, чтобы обеспечить высокую пропускную способность при получении серий наклонов, что значительно улучшает использование микроскопа.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Криогенная электронная томография
- Высокопроизводительное получение изображений
- Методы микроскопии
Предпосылки
- Растущий спрос на сбор данных в больших масштабах
- Времяемеющие установки могут ограничивать эффективное время работы микроскопа
- Важность эффективных методов сбора томографических данных
Используемые методы
- Протокол для автоматизированного сбора данных томографии
- Использование SerialEM для навигации по картированию квадратов сетки
- Реализация виртуальных карт для центрирования цели
Основные результаты
- Было выявлено 71 квадрат сетки для получения данных
- Эффективный сбор данных с общим временем получения 3 часа 45 минут
- Продемонстрированная способность эффективно визуализировать образцы коронавирусов
Выводы
- Это исследование иллюстрирует упрощенный подход к высокопроизводительному изображению в томографии
- Результаты подчеркивают важность максимизации эффективности получения данных в биологических исследованиях
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Efficient cryogenic electron tomography (cryoET) data acquisition is critical for high-resolution structural biology, enabling rapid and reproducible 3D analysis of macromolecular complexes. Automated workflows using SerialEM and PyEM streamline grid mapping and target selection, maximizing microscope utilization and reducing operational bottlenecks. These advances directly impact early discovery and structural validation pipelines in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Accelerates structural interrogation of biological assemblies in near-native states.
- Supports functional target validation by enabling high-throughput acquisition of tilt series.
- Improves predictive confidence in macromolecular complex analysis for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Enables preparation of validated 3D structural datasets for downstream screening workflows.
- Standardizes acquisition routines, enhancing reproducibility and quantitative output quality.
- Facilitates scalable, automated data collection for reliable compound evaluation platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data acquisition with disease-relevant systems, such as viral particles.
- Ensures continuity from discovery-stage imaging to preclinical structural validation.
- Reduces risk in translational research by supporting robust, high-throughput data generation.
Pipeline & Workflow Integration
This automated cryoET workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting structural hypothesis testing and target de-risking.
- Discovery Biology: Enables rapid hypothesis testing and pathway clarification via high-resolution 3D imaging.
- Screening: Provides reproducible, quantitative tilt series datasets for assay readiness.
- Analytics: Delivers standardized measurements and readouts for comparative structural analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when imaging disease-relevant complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for automated tomography data acquisition across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of data acquisition sessions.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by maximizing instrument time.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryoEM instrumentation and data analysis software.
- Depends on access to high-end transmission electron microscopes and computational infrastructure.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters and data management practices.
- May require adaptation for different sample types or grid formats.
- Operational limitations include manual input for initial target selection and quality assessment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Selecting the Targets
1:31
Generate Virtual Maps
2:07
Microscope Tuning
2:43
Set up Navigator
4:05
Set the Focus/Track Positions
5:00
Set up Additional Scripts
5:27
Run
6:19
Results: Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition
7:46
Conclusion
