Стратегии оптимизации сбора данных криогенной электронной томографии
19 марта 2021 г.
Растущий спрос на крупномасштабный сбор данных в криогенной электронной томографии требует высокопроизводительных процедур получения изображений. Здесь описан протокол, который реализует последние разработки передовых стратегий сбора, направленных на максимизацию эффективности времени и пропускной способности сбора томографических данных.
Настройка крупномасштабного сеанса сбора данных является трудоемкой процедурой, которая может значительно сократить оставшееся время микроскопа, доступное для получения серии наклона. Этот метод позволяет быстро настроить крупномасштабный автоматизированный сбор данных томографии для максимизации эффективности времени томографических экспериментов, требующих тщательного выбора целей сбора. Начните с открытия фиктивного экземпляра SerialEM.
После того, как первый квадрат сетки сопоставлен, используйте пункт меню навигатора SerialEM, чтобы увидеть монтаж в фиктивном экземпляре SerialEM. Дважды щелкните окно навигатора, чтобы открыть квадратную карту сетки. Выполните поиск по карте и воспользуйтесь фиктивной опцией навигатора SerialEM, чтобы добавить точки получения изображений на интересуемую цель.
После сопоставления новых квадратов сохраните файл навигатора и снова объедините навигатор. Продолжайте до тех пор, пока не будут сопоставлены все квадраты сетки. Снова объедините файл навигации с фиктивным экземпляром SerialEM.
Запустите скрипт виртуальных карт Pi EM из фиктивного меню SerialEM. Выберите инструменты и выберите виртуальные якорные карты. Это может занять некоторое время в зависимости от размера и количества квадратных карт сетки, а также от биннинга карт просмотра и предварительного просмотра.
Чтобы обеспечить надлежащую производительность микроскопа, используйте ту же настройку увеличения и размера пучка для сбора данных в следующем порядке. Выполните выравнивание SerialEM без комы с помощью CTF. Вставьте и центрите объективную диафрагму.
Запустите SerialEM корректный астигматизм с помощью CTF и GIF быстрой настройки. В SerialEM откройте новый файл навигатора. Считаем все точки А.
Выберите первый вид карт. Выберите свернуть. Дважды нажмите A и сверните сворачивание.
Выберите первую позицию карты. Нажмите Shift T, затем выберите самую последнюю позицию карты и нажмите Shift T еще раз. Выберите однорамочные изображения в свойствах файла, чтобы открыть диалоговое окно.
В следующем диалоговом окне свойств файла выберите нужные параметры в соответствии с потребностями в создании изображений и настройкой прибора. При появлении запроса дайте имя с номером и нажмите «Сохранить». Настройте контроллер серии наклона для первого положения TS.
По завершении нажмите кнопку ОК, чтобы задать эти параметры для всех серий наклонов после этого элемента сбора. Все карты предварительного просмотра теперь выбираются как TS с пронумерованным именем файла. При необходимости установите расстояние фокусировки/трека для каждой цели.
Дважды щелкните на карте просмотра, чтобы загрузить ее. Выберите карту предварительного просмотра в списке навигатора. Затем выберите «Редактировать фокус» в окне навигатора.
На панели управления низкой дозой откажитесь от выбора, поверните межосевую ось, чтобы расположить испытание и сфокусироваться вдоль оси наклона ступени. Щелкните нужную область на загруженной карте просмотра, чтобы установить пробное положение фокуса для этой серии наклонов и убедиться, что элемент навигатора имеет TSP. Повторите процедуру для всех элементов.
Отредактируйте диапазон фокусировки в скрипте PreTomo, который запускается перед каждым рядом наклона. В меню SerialEM tilt series проверьте сценарий запуска в TS и выберите номер сценария DuringTomo во время каждого наклона. Проверьте уровень азотного бака и то, выбран ли турбонаддув автозагрузчика.
Проверьте свободное место в хранилище данных. В меню Файл SerialEM сняте выбор параметра Непрерывное сохранение файла журнала. Каждая серия наклонов получит свой собственный файл журнала.
После нажатия на приобретаемые элементы в навигационном меню, запустите скрипт PreTomo. Выберите основную задачу получения серии наклонов, затем выберите запустить сценарий после PostTomo. Выберите закрыть клапаны столбцов в конце и отправьте электронное письмо в конце, затем нажмите «Перейти».
71 подходящий квадрат был выбран на карте сетки при меньшем увеличении. Были получены карты среднего увеличения с настройками, которые позволяют напрямую визуализировать и идентифицировать интересующий образец, в данном случае коронавирусов. Время приобретения составило три минуты на квадрат, в общей сложности три часа и 45 минут.
Когда была создана первая квадратная карта, на отдельном компьютере был открыт фиктивный экземпляр SerialEM для визуализации квадратной карты и добавления точек на мишенях, подходящих для получения серии наклона. Была настроена низкая доза SerialEM, а изображения с контрольным видом и предварительным просмотром были взяты и сохранены в виде карт. Последние карты затем могут быть немедленно использованы на фиктивном экземпляре SerialEM для создания виртуального представления и виртуального предварительного просмотра из соответствующих квадратных изображений карты.
Карты виртуального вида использовались для первоначального центрирования цели, за которым последовало окончательное центрирование, выполненное при фактическом увеличении сбора серии наклона с использованием виртуальной карты предварительного просмотра. Пользователи должны предоставить себе достаточно времени для изучения ландшафта образцов. После поиска на некоторых картах вы лучше чувствуете области хорошего качества для сбора данных.
Обзор
В данном протоколе подробно описан эффективный рабочий процесс для крупномасштабного автоматизированного сбора данных криоэлектронной томографии (cryoET), направленный на максимальное использование времени работы микроскопа и оптимизацию выбора целей для анализа. Благодаря использованию скриптов SerialEM и программного обеспечения PyEM данный метод обеспечивает автоматизированное картирование сеток, выбор целей и сбор серий наклонов, что значительно сокращает время на подготовку и необходимость ручного вмешательства.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Криоэлектронная томография (cryoET)
- Структурная биология
- Автоматизация электронной микроскопии
Теоретические сведения
- Криоэлектронная томография (CryoET) позволяет осуществлять 3D-визуализацию биологических образцов в состоянии, близком к естественному.
- Для получения структур с высоким разрешением требуется сбор многочисленных серий наклонов с использованием современных электронных микроскопов.
- Ручной выбор интересующих областей занимает много времени и ограничивает пропускную способность микроскопа.
- Программы автоматизированного сбора данных стали более совершенными, однако выбор целей по-прежнему остается узким местом.
Цель исследования
- Представить протокол, автоматизирующий картирование сеток и квадратов сеток, а также сбор серий наклонов в криоэлектронной томографии (cryoET).
- Продемонстрировать, как использование SerialEM и PyEM позволяет оптимизировать крупномасштабный сбор данных.
- Проиллюстрировать применение данного протокола при сборе данных серий наклонов для Sars-Cov-2.
Используемые методы
- Настройка фиктивного экземпляра SerialEM для картирования и выбора целей.
- Автоматизированное картирование и объединение квадратов сетки с помощью инструментов навигатора SerialEM.
- Создание виртуальных видов и карт предварительного просмотра для центрирования целей.
- Автоматизированный сбор серий наклонов с использованием скриптов для фокусировки, выравнивания и управления данными.
Основные результаты
- Было выбрано и картировано при малом увеличении 71 подходящий квадрат сетки.
- Карты при среднем увеличении позволили напрямую визуализировать и идентифицировать объекты (например, коронавирусы).
- Время сбора данных составляло примерно три минуты на квадрат, что в сумме составило три часа 45 минут.
- Виртуальные карты обеспечили эффективное центрирование и наведение на цель при сборе серий наклонов.
Выводы
- Данный протокол значительно повышает эффективность сбора данных криоэлектронной томографии (cryoET) по времени.
- Автоматизированное картирование и выбор целей снижают трудозатраты и максимально оптимизируют использование микроскопа.
- Предложенный рабочий процесс особенно подходит для экспериментов, требующих тщательного отбора целей и высокопроизводительного получения серий наклонов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Эффективный сбор данных криоэлектронной томографии (cryoET) имеет решающее значение для структурной биологии высокого разрешения, обеспечивая быстрый и воспроизводимый 3D-анализ макромолекулярных комплексов. Автоматизированные рабочие процессы с использованием SerialEM и PyEM оптимизируют картирование сеток и выбор мишеней, максимально увеличивая эффективность использования микроскопа и устраняя эксплуатационные трудности. Эти достижения напрямую влияют на процессы раннего поиска и структурной валидации в биофармацевтических исследованиях и разработках (R&D).
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках&D
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Ускоряет структурный анализ биологических сборок в состояниях, близких к нативным.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней за счет возможности высокопроизводительного сбора серий наклонов.
- Повышает достоверность прогнозов при анализе макромолекулярных комплексов для сортировки портфеля проектов.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные наборы данных о 3D-структурах для последующих рабочих процессов скрининга.
- Стандартизирует процедуры сбора данных, повышая воспроизводимость и качество количественных результатов.
- Обеспечивает масштабируемый автоматизированный сбор данных для надежных платформ оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет сбор структурных данных с системами, имеющими значение для заболевания, такими как вирусные частицы.
- Обеспечивает преемственность от визуализации на этапе открытия до доклинической структурной валидации.
- Снижает риски в трансляционных исследованиях за счет поддержки надежной высокопроизводительной генерации данных.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Этот автоматизированный рабочий процесс крио-ЭТ объединяет этапы от раннего поиска до идентификации ведущих соединений и доклинических исследований, обеспечивая проверку структурных гипотез и снижение рисков при выборе мишеней.
- Открывающая биология: позволяет быстро проверять гипотезы и уточнять сигнальные пути с помощью 3D-визуализации высокого разрешения.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные наборы данных серий наклона для подготовки анализов.
- Аналитика: предоставляет стандартизированные измерения и результаты для сравнительного структурного анализа.
- Трансляционные исследования: способствует согласованию биомаркеров и обеспечению преклинической преемственности при визуализации комплексов, имеющих значение для заболевания.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемую, многоразовую платформу для автоматизированного сбора данных томографии в рамках различных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в структурных исследованиях.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и пропускную способность сеансов сбора данных.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и повышает эффективность использования капитала за счет максимизации времени работы приборов.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение структурно подтвержденных мишеней.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области оборудования для криоэлектронной микроскопии (cryoEM) и программного обеспечения для анализа данных.
- Зависит от наличия доступа к высокотехнологичным просвечивающим электронным микроскопам и вычислительной инфраструктуре.
- Требуется межкомандная стандартизация параметров сбора данных и методов управления данными.
- Может потребоваться адаптация для различных типов образцов или форматов сеток.
- Операционные ограничения включают ручной ввод при первоначальном выборе мишени и оценке качества.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Selecting the Targets
1:31
Generate Virtual Maps
2:07
Microscope Tuning
2:43
Set up Navigator
4:05
Set the Focus/Track Positions
5:00
Set up Additional Scripts
5:27
Run
6:19
Results: Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition
7:46
Conclusion
