Направленная дифференцировка гемогенных эндотелиальных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека
31 марта 2021 г.
Здесь представлен простой протокол направленной дифференцировки гемогенных эндотелиальных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека примерно за 1 неделю.
Этот протокол подробно описывает метод генерации хорошо охарактеризованной популяции гемогенных эндотелиальных клеток человека. Эти клетки могут быть использованы для изучения молекулярной регуляции и эндотелиального перехода к кроветворению. Начните с культивирования эмбриональных стволовых клеток человека в течение четырех дней, чтобы дифференцировать их в первичные эндотелиальные клетки.
На пятый день аспирируйте среду над клетками. Затем аккуратно промыть клетки одним миллилитром DMEM/F-12 на лунку. Добавьте один миллилитр свежеприготовленной гемогенной среды дифференцировки эндотелиальных клеток на лунку и инкубируйте клетки в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
На шестой и седьмой день замените среду над клетками одним миллилитром свежеприготовленной гомогенной среды дифференцировки эндотелиальных клеток на лунку и инкубируйте клетки еще 24 часа. На восьмой день. после отсоединения и промывки клеток делят их равномерно на микроцентрифужные трубки на льду, каждая из которых содержит минимум 600 микролитров клеток при плотности от 1 раза 10 до 5-й ячейки на миллилитр.
Добавьте антитела в трубки, содержащие клетки по мере необходимости, и инкубируйте на льду, защищенном от света, в течение 30 минут. Гранулируйте ячейки центрифугированием при 1000 G и 4 градусах Цельсия в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулы в 600 микролитров ледяного сортировочного буфера.
Процедите образцы через крышку сетчатого фильтра из пяти миллилитровых трубок FACS и храните ячейки на льду, защищенном от света, для немедленной сортировки клеток. Чтобы изолировать гемогенные эндотелиальные клетки с помощью FACS, сначала защитите CD45-отрицательную клеточную популяцию. Затем в пределах CD45-отрицательной популяции затвор CD31-положительных клеток.
Следующий в CD31-положительной популяции, ворота для VE-кадгерин-отрицательной клеточной популяции. А затем в пределах VE-кадгерин-отрицательной популяции, ворота для c-Kit-положительных клеток. Из c-Kit-положительной популяции выйдите из CD34-положительной клеточной популяции.
И, наконец, из CD34-положительной клеточной популяции, идентифицируйте и собирайте KDR-положительные клетки. После посева гемогенных эндотелиальных клеток в среду на основе метилцеллюлозы, разработанную для роста гемопоэтических клеток-предшественников, колониеобразующих колоний unit-erythroid и бласт-образующих unit-erythroid колоний, подсчитывают на восьмой день. Колониеобразующая единица - гранулоцит-макрофаг и колониеобразующая единица - гранулоцит, эритроид, макрофаг и мегакариоцит.
Мультипотентные кроветворные колонии-прародители подсчитывают на 14 день. На 1000 покрытых гемогенных эндотелиальных клеток образуется около 20 колониеобразующих единиц. Клетки с морфологией эндотелиальных клеток также видны в культурах.
Это гемогенные эндотелиальные клетки, которые дают начало многолинейным кроветворным предшественникам на одноклеточном уровне. Этот протокол представляет собой 2D-систему культур без сыворотки и мышей, которая может генерировать гемогенные эндотелиальные клетки человека примерно за одну неделю.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол получения гемогенных эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека примерно за одну неделю. Этот метод позволяет исследователям получать хорошо охарактеризованную популяцию данных клеток, которые имеют решающее значение для изучения эндотелиально-гемопоэтического перехода и могут быть использованы в регенеративной медицине и при производстве компонентов крови.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Биология сосудов
- Гемопоэз
- Тканевая инженерия
Теоретическая часть
- Кровеносные сосуды необходимы для функционирования тканей и выстланы васкулярными эндотелиальными клетками.
- Гемогенные эндотелиальные клетки представляют собой специализированный подтип, который в процессе развития дает начало гемопоэтическим стволовым клеткам и клеткам-предшественникам.
- Получение этих клеток in vitro имеет большое значение для изучения развития клеток крови и возможного терапевтического применения.
- Существующие протоколы получения эндотелиальных клеток не позволяют получить хорошо охарактеризованные гемогенные эндотелиальные клетки из стволовых клеток человека.
Цель исследования
- Разработать воспроизводимый протокол получения гемогенных эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека.
- Обеспечить возможность изучения молекулярной регуляции и эндотелиально-гемопоэтического перехода in vitro.
- Создать систему без использования фидерных клеток и сыворотки, подходящую для последующих приложений.
Используемые методы
- Культивирование эмбриональных стволовых клеток человека и пошаговая дифференцировка в течение восьми дней.
- Индукция мезодермального и эндотелиального направлений дифференцировки с использованием специфических факторов роста и малых молекул (например, ингибитора GSK3β, bFGF, BMP4, VEGF-A, ретиноевой кислоты).
- Проточная цитометрия (FACS) для последовательного гейтирования и изоляции гемогенных эндотелиальных клеток на основе поверхностных маркеров (CD45-, CD31+, VE-cadherin-, c-Kit+, CD34+, KDR+).
- Функциональная оценка с помощью анализа колониеобразующей способности в среде на основе метилцеллюлозы для определения гемопоэтического потенциала.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет получить определенную популяцию гемогенных эндотелиальных клеток в течение одной недели.
- Образуется примерно 20 колониеобразующих единиц на 1000 гемогенных эндотелиальных клеток, что свидетельствует о высоком гемопоэтическом потенциале.
- Наблюдаются как эритроидные, так и мультипотентные колонии гемопоэтических клеток-предшественников.
- Морфология эндотелиальных клеток сохраняется в культуре, что подтверждает идентичность клеток.
Выводы
- Данный протокол, не требующий использования фидерных клеток и сыворотки, позволяет эффективно получать человеческие гемогенные эндотелиальные клетки из эмбриональных стволовых клеток.
- Метод облегчает проведение исследований in vitro по переходу эндотелия в гемопоэтические клетки и изучению молекулярной регуляции этого процесса.
- Он создает платформу для потенциального получения препаратов крови ex vivo и снижает зависимость от доноров человеческой крови.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Направленная дифференцировка гемогенных эндотелиальных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека позволяет преодолеть критический барьер в моделировании гемопоэза и генерации кроветворных линий ex vivo. Эта возможность обеспечивает механистическое снижение рисков при изучении эндотелиально-гемопоэтического перехода и повышает прогностическую достоверность на ранних этапах разработки клеточной терапии и методов регенеративной медицины. Безбесклеточный и безсывороточный дизайн данного протокола повышает воспроизводимость и масштабируемость для портфелей корпоративных исследований и разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее открытие и валидация мишени
- Позволяет исследовать молекулярные пути, регулирующие эндотелиально-гемопоэтический переход.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней для факторов, влияющих на спецификацию клеточных линий крови.
- Способствует прогностическому снижению рисков при выборе потенциальных мишеней в процессе гемопоэтического развития.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает получение стандартизированной, хорошо охарактеризованной популяции клеток для последующих функциональных анализов.
- Позволяет проводить количественную оценку формирования гемопоэтических колоний из определенных клеток-предшественников.
- Обеспечивает воспроизводимый скрининг модуляторов, влияющих на эндотелиальную или гемопоэтическую дифференцировку.
Трансляционные и доклинические исследования
- Создает платформу для моделирования значимых для заболевания гемопоэтических дефектов in vitro.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации стратегий генерации клеток крови.
- Поддерживает продвижение концепций клеточной терапии с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол встраивается в континуум от этапа первичного открытия до доклинических исследований, обеспечивая надежную генерацию и изоляцию гемогенных эндотелиальных клеток для механистических исследований и функциональных анализов.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о молекулярной регуляции возникновения кровных линий.
- Скрининг: дает воспроизводимые количественные результаты образования колоний для сравнительного анализа.
- Аналитика: обеспечивает гейтирование на основе проточной цитометрии и количественное определение колоний для получения объективных данных.
- Трансляционные исследования: связывает моделирование in vitro с доклинической оценкой гемопоэтического потенциала.
- Корпоративное использование: предлагает масштабируемую систему без использования фидерных клеток, адаптируемую для различных линий стволовых клеток и моделей заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность моделирования гемопоэтических линий и валидации мишеней.
- Операционная ценность: Повышает уровень стандартизации, воспроизводимости и масштабируемости рабочих процессов дифференцировки клеток.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности продолжения (go/no-go) программ в области клеточной терапии и регенеративной медицины.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию кандидатов на ранних стадиях разработки клеточных терапевтических средств с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами плюрипотентных стволовых клеток человека и протоколами их дифференцировки.
- Необходим доступ к оборудованию для проточной цитометрии для многопараметрической сортировки клеток.
- Требуется межгрупповая стандартизация стратегий гейтирования и количественного анализа колоний.
- Метод может быть адаптирован для различных линий стволовых клеток человека при условии оптимизации протокола.
- Результаты зависят от использования валидированных панелей антител и функциональных анализов на основе метилцеллюлозы.
