Нейтронная спиновая эхо-спектроскопия как уникальный зонд для динамики липидных мембран и мембранно-белковых взаимодействий
27 мая 2021 г.
В данной статье описываются протоколы подготовки образцов, восстановления данных и анализа данных в исследованиях нейтронного спинового эха (NSE) липидных мембран. Разумное дейтериевое маркировка липидов обеспечивает доступ к различной динамике мембран на мезоскопических масштабах длины и времени, в которых происходят жизненно важные биологические процессы.
Этот протокол описывает подготовку образцов и уменьшение данных, необходимых для успешных исследований спинового эха нейтронов коллективных флуктуаций мембран, имеющих отношение к биологическим функциям и практическому применению липидных мембран. NSE напрямую обращается к динамике мембраны на наносекундных временных масштабах ключевых мембранных функций с уникальным преимуществом чувствительности к изотопам для зондирования селективных особенностей мембраны, недоступных с другими методами. Исследования динамики мембран на наноуровне имеют важное значение для понимания свойств мембраны молекулярного механизма и мембранно-белковых взаимодействий, замешанных в различных клеточных патологиях.
Метод предоставляет исследователям, новичкам в NSE, подробные рекомендации по проектированию, подготовке и характеристике липидных везикул для успешных экспериментов и последующего анализа и интерпретации сокращения данных. Продемонстрировать процедуру будут Тешани Кумараге и Джули Нгуен, аспирант и студентка лаборатории. Работая внутри вытяжки, подготовьте липидную суспензию, растворив точно взвешенные липиды в одном миллилите растворителя с ручным смешиванием.
Высушите липидный раствор, осторожно вливая инертный газ во флакон, медленно вращая его под углом. Чтобы тщательно удалить остаточный растворитель, поместите флаконы на ночь в вакуумную печь при температуре 35 градусов Цельсия. На следующий день увлажняют липидную пленку двумя миллилитрами тяжелой воды для получения концентрации липидов 50 миллиграммов на миллилитр и вихряют гидратированную липидную суспензию до полного растворения липидной пленки.
Затем выполните пять циклов замораживания-оттаивания, храня флакон с гидратированной липидной суспензией при минус 80 градусах Цельсия до замораживания. А затем перенести его на водяную баню при 35 градусах Цельсия, чтобы разморозить липидную суспензию. Вихрь размороженный суспензии до однородной точки, прежде чем перейти к следующему циклу.
Перед началом эксперимента соберите установку экструдера с использованием поли-бикарбонатной мембраны между двумя мембранными опорами и добавьте два бумажных фильтра с каждой стороны, чтобы обеспечить дополнительную поддержку. Используйте герметичные стеклянные шприцы для гидратации поликарбонатной мембраны, пропуская 0,3 миллилитра тяжелой воды через мембранный узел несколько раз. После гидратации мембраны вставляют в один конец газонепроницаемый шприц на один миллилитр с приготовленным раствором липидов молочно-белого цвета, а в противоположный конец экструдерного аппарата – пустой шприц.
После подключения шприцев поместите узел в блок экструдера. Запрограммируем насос, удерживая кнопку Rate для ввода скорости экструзии и нажав кнопку Diameter, чтобы ввести диаметр шприца. Затем нажимайте «Снять», пока не загорится индикатор.
Нажмите кнопку Пуск и подождите, пока образец начнет дозировать в пустой шприц. Нажмите кнопку Стоп непосредственно перед тем, как образец шприца полностью опустеет. Запишите дозированную громкость, затем удерживайте кнопку «Скорость» до тех пор, пока на экране не появится первая фаза.
Не выключая индикатор «Вывести», нажмите кнопку громкости, чтобы ввести дозированную громкость, записанную ранее. Нажмите кнопку «Скорость» еще раз и используйте стрелку вверх вправо для доступа ко второму этапу. Нажмите «Громкость», чтобы ввести то же значение дозированного объема, которое было записано ранее.
На этом этапе нажимайте кнопку «Вывести», пока не загорится индикатор «Вывести». Повторите цикл для третьей фазы, нажимая кнопку регулировки громкости, пока на экране не появится LP:SE, и установите для нее значение 20. Наконец, нажмите кнопку Rate, получите доступ к четвертому этапу и нажмите кнопку громкости, чтобы нажать функцию Stop, чтобы завершить настройку насоса.
После того, как насос запрограммирован, нажмите кнопку Пуск, чтобы начать цикл экструзии. Выполните от 15 до 20 циклов экструзии, прежде чем собирать прозрачную опаловую синюю экструдированную липидную суспензию в чистый флакон для измерений. Откройте программное обеспечение DAVE и выберите уменьшить данные NSE в меню Сокращение данных.
Загрузите файлы данных с различными значениями Q с помощью меню «Открыть эхо-файлы» в меню «Файл». Загруженные файлы будут отображаться под доступными наборами данных. Щелкните правой кнопкой мыши на выбранном файле и пометьте его в соответствии с измерением, которое он соответствует, например Образец, Ячейка или Разрешение.
На вкладке Набор данных сгруппируйте пиксели детектора в 2 X 2, чтобы улучшить соотношение сигнал/шум. Примените одно и то же биннинг ко всем файлам Разрешения, Ячейки и Образца. Проверьте данные по всем группам пикселей и замаскируйте данные с плохими сигналами, нажав клавишу End на клавиатуре.
Нажмите клавишу ВВОД, чтобы открыть всплывающее окно, чтобы применить одну и ту же маску ко всем четырем временам. Замаскированные пиксели станут зелеными. Убедитесь, что собранные данные в виде эхо-сигнала.
Начните подгонку файла разрешения из списка загруженных файлов, щелкнув правой кнопкой мыши по нужному файлу и выбрав Fit Operations, Fit Echoes Resolution во всплывающем меню. Убедитесь, что припадки эхо-сигналов дают разумные параметры подгонки. Чтобы проверить ошибку, связанную с каждым параметром подгонки, по всему детектору, выберите Параметры изображения, а затем выберите интересующую параметр подгонки.
Затем щелкните правой кнопкой мыши на изображении детектора, чтобы получить доступ к всплывающему окну, показываю карту панели ошибок. Если подгонка по определенному пикселю неудовлетворительна, переназначите сигнал поверх этого пикселя, выбрав его, нажав вкладку «Подгонка», а затем нажав «Попиксель по пикселю». Введите новые начальные параметры для фазы и периода на вкладке Подгонка.
Уменьшите размер файла образца, выбрав соответствующий файл из списка загруженных и помеченных файлов. Проверьте все пиксели и замаскируйте бедные, как описано выше. Затем щелкните правой кнопкой мыши файл и выберите Операции подгонки, Этапы импорта.
Для файла разрешения подогнать эхо-сигналы, как описано выше, со значениями периода без изменений и фазовой точкой эха, импортированной из разрешения. Введите центр луча для всех файлов данных, перейдя на вкладку Общие и введя значения центров пучка X и Y, записанные в эксперименте. После завершения подгонки рассчитайте нормализованную промежуточную функцию рассеяния, щелкнув правой кнопкой мыши нужный образец файла из списка подходящих файлов и выбрав Calculate I of Q во всплывающем меню.
Во всплывающем окне введите необходимую информацию для файлов разрешения и ячеек, а также количество Q-дуг, затем нажмите OK для просмотра результатов. Обратите внимание, что данные в циане показывают плохой сигнал из-за эффектов края детектора и должны быть устранены при компиляции различных наборов данных Q. Наконец, сохраните уменьшенные наборы данных в виде файлов ASCII и сохраните весь сеанс как проект DAVE в нужной папке.
В этом исследовании были проведены измерения NSE липосомальных образцов, подготовленных с различными схемами дейтерации. NSE измерения флуктуаций изгиба мембраны выполняются на полностью контрастных липосомах. Эта схема дейтерации приводит к большой разнице длин рассеяния между ядром мембраны и дейтерированной жидкой средой, значительно усиливая сигнал рассеяния от липосомальных мембран и улучшая статистику измерения динамики изгиба.
С другой стороны, NSE измерения флуктуаций толщины мембраны липосом показывают отклонения относительно Q к третьей зависимости флуктуаций изгиба. Для выделения флуктуаций толщины сигнала полученный сигнал разделяют на Q на третий и избыточную динамику подогнали к лоренциановской функции в Q.Этот метод зависит от данных хорошего качества, которые более достижимы с образцами высоких концентраций и сильными сигналами рассеяния. Динамика, исследуемая NSE, может быть синергетически исследована дейтериевой ЯМР-релаксометрией и молекулярно-динамическим моделированием, чтобы проиллюстрировать, как молекулярные липидные структуры и мотивы упаковки влияют на функции мембраны.
Исследования NSE на липидных мембранах проливают новый свет на биофизику мембран, сложные отношения структуры и динамики мембраны и то, как они влияют на мембранные функции и мембранно-белковые взаимодействия.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье подробно описывается протокол использования спектроскопии нейтронного спинового эхо (NSE) для изучения коллективных флуктуаций мембран в липидных бислоях, которые имеют решающее значение для понимания биофизики мембран и мембранно-белковых взаимодействий. Протокол охватывает подготовку образцов, схемы дейтерирования, сбор и обработку данных, предоставляя исследователям исчерпывающие рекомендации для успешного проведения экспериментов NSE на липосомальных мембранах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биофизика мембран
- Спектроскопия нейтронного спинового эха
- Динамика липидных везикул
Теоретическая часть
- Липидные бислои имеют фундаментальное значение для структуры и функции клеточных мембран.
- Жесткость и текучесть мембран необходимы для таких клеточных процессов, как обмен питательными веществами и белковые взаимодействия.
- Понимание динамики мембран в наносекундном временном масштабе имеет решающее значение для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе свойств мембран и патологий.
- NSE-спектроскопия, особенно с использованием дейтериевого мечения, позволяет напрямую исследовать изгибы мембраны и флуктуации ее толщины.
Цель исследования
- Предоставить подробный протокол подготовки и анализа липосомальных образцов для исследований методом NSE.
- Продемонстрировать, как NSE может быть использован для измерения динамики мембран, имеющей значение для биологических функций.
- Проиллюстрировать влияние схем дейтерирования на качество и интерпретацию данных.
Используемые методы
- Приготовление липидных суспензий и формирование липосом с помощью циклов замораживания-оттаивания и экструзии через поликарбонатные мембраны.
- Применение схем дейтерирования для усиления контраста рассеяния для специфических особенностей мембран.
- Сбор данных NSE при различных значениях Q и их обработка с использованием программного обеспечения DAVE.
- Анализ данных, включая группировку пикселей, маскирование, аппроксимацию эхо-сигналов и расчет нормированных промежуточных функций рассеяния.
Основные результаты
- Измерения методом NSE на дейтерированных липосомальных образцах значительно усиливают сигнал рассеяния, что улучшает статистику измерений динамики изгиба.
- Флуктуации изгиба мембраны следуют зависимости Q3, в то время как флуктуации толщины отклоняются от нее, что позволяет выделить их и проанализировать с помощью аппроксимации функцией Лоренца.
- Высокое качество данных необходимо для точного извлечения параметров мембраны, таких как жесткость на изгиб и модуль сжимаемости площади.
- Данные NSE могут быть дополнены релаксометрией ЯМР на дейтерии и моделированием молекулярной динамики для более глубокого понимания взаимосвязи между структурой и функцией мембраны.
Выводы
- Спектроскопия NSE является мощным инструментом для изучения наноразмерной динамики мембран, имеющей значение для биологической функции.
- Тщательная подготовка образцов и анализ данных имеют решающее значение для получения надежных результатов.
- Исследования методом NSE углубляют понимание взаимосвязи между структурой, динамикой и функцией мембран, включая взаимодействия мембраны с белками.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Спектроскопия нейтронного спинового эха (NSE) позволяет проводить прямое количественное измерение динамики липидных мембран и мембранно-белковых взаимодействий в наносекундном временном диапазоне, что дает критически важное понимание биофизических свойств, лежащих в основе клеточных функций. Эта возможность повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней на ранних этапах и снижает механистические риски в программах разработки лекарственных средств, воздействующих на мембранные белки. Уникальная чувствительность NSE к коллективным флуктуациям мембран позволяет обоснованно принимать решения по формированию портфеля препаратов в тех случаях, когда взаимосвязь структуры и функции мембран занимает центральное место в терапевтических гипотезах.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать эластичность и текучесть мембраны, имеющие значение для взаимодействия с мишенью.
- Способствует снижению механистических рисков за счет количественной оценки динамики взаимодействия мембраны с белками.
- Обеспечивает функциональную валидацию моделей мембран, используемых при оценке мишени.
Скрининг и разработка методов анализа
- Облегчает подготовку хорошо охарактеризованных липосомальных систем для последующих рабочих процессов скрининга.
- Предоставляет количественные показатели, такие как жесткость на изгиб и сжимаемость площади, для стандартизации анализа.
- Повышает воспроизводимость и сопоставимость анализов на основе мембран благодаря надежным протоколам обработки данных.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет биофизические параметры мембран с моделями, соответствующими патологии, для обеспечения трансляционной преемственности.
- Обеспечивает продвижение с учетом рисков путем установления связи между наноразмерной динамикой мембран и функциональными результатами.
- Поддерживает интеграцию с дополнительными методами для комплексной доклинической характеристики.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Спектроскопия NSE находится на стыке фундаментальной биологии и доклинических исследований, связывая механистические исследования динамики мембран с функциональной валидацией в системах, релевантных для конкретных заболеваний.
- Открывающая биология: Количественная оценка коллективных флуктуаций мембраны для выяснения биофизических механизмов, лежащих в основе функции мишени.
- Скрининг: Обеспечение стандартизированных количественных показателей для аналитических платформ на основе мембран.
- Аналитика: Определение жесткости на изгиб, сжимаемости по площади и плоскостной вязкости для сравнительного анализа при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Связь динамики мембран с доклиническими моделями, что при необходимости способствует согласованию биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Создание многократного используемой платформы для биофизики мембран, применимой в рамках нескольких программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при поиске мишеней в мембранах и снижает механистическую неопределенность.
- Операционная ценность: стандартизирует подготовку образцов мембран и анализ данных для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: помогает принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя количественные, механистически значимые данные на ранних этапах процесса.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию мембранно-ориентированных мишеней и модальностей с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в подготовке липидных везикул, дейтерировании и методах нейтронного рассеяния.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию и аналитическому программному обеспечению (например, DAVE).
- Межкомандная стандартизация процедур обработки образцов и протоколов редукции данных имеет решающее значение для воспроизводимости.
- Адаптация к различным липидным составам или белковым комплексам может потребовать оптимизации протокола.
- Для получения сильного сигнала и надежного извлечения параметров необходимы высококачественные образцы с высокой концентрацией.
