Анализ отслеживания наночастиц для количественной оценки и определения размера внеклеточных везикул

Результаты NTA очень подвержены смещению оператора. Данный протокол демонстрирует влияние измененных параметров НТА на полученные результаты. Стандартизированный метод поможет повысить строгость и воспроизводимость анализа NTA.

Анализ выборки в кювете позволяет получить статистически случайную выборку в каждом видео. Это приводит к более воспроизводимым данным и визуализации частиц в широком диапазоне размеров. Поскольку получение образца в рекомендуемом диапазоне концентраций частиц может быть затруднено, обязательно выполните последовательное разбавление, чтобы определить идеальный коэффициент разбавления.

Продемонстрировать процедуру будет Кунхенг Кай, аспирант из лаборатории Энтони Ферранте. Чтобы подготовить кювету для анализа отслеживания наночастиц, накройте рабочее пространство безворсовым материалом, чтобы предотвратить попадание волокон в кюветы. Надев перчатки, поместите кювету, содержащую перемешиватель, на магнитный джиг кюветы.

Используйте инструмент для крючка, чтобы поместить вставку в кювету с выемкой вставки, видимой в передней части кюветы. Используйте пипетку, чтобы медленно добавить от 400 до 500 микролитров очищенных внеклеточных везикул на кювету через отверстие во вставке и перемешать образец, осторожно пипетируя без введения пузырьков воздуха, затем закройте кювету, вырезая пузырьки по мере необходимости и используйте безворсовую ткань, чтобы протереть внешнюю поверхность кюветы. Чтобы проанализировать концентрацию частиц разлучительного или образца, включите компьютерную рабочую станцию и прибор и запустите программу анализа отслеживания частиц.

При появлении запроса щелкните NTA и откройте вкладку записи. Следуйте инструкциям на экране, чтобы заполнить всю необходимую информацию. Для анализа отслеживания электромобилей установите разбавитель в PBS.

Соленость будет автоматически заполняться до 9% Чтобы получить концентрацию разлучатель или частиц образца, откройте крышку прибора и снимите защитное покрытие крышки, где будет помещена кювета. Загрузите кювету в прибор в правильной ориентации с выемкой вставки, обращенной к камере, и замените колпачок и крышку прибора. Щелкните стрелку потоковой передачи, чтобы включить камеру, и щелкните стрелку шеврона, чтобы развернуть настройки записи.

Отрегулируйте фокус до тех пор, пока относительно небольшие частицы не будут хорошо видны. Чтобы установить анализ для небольшой количественной оценки EV, установите частоту кадров на 30 кадров в секунду, экспозицию на 15 миллисекунд, время перемешивания на пять секунд, время ожидания на три секунды, мощность синего, зеленого и красного лазера на 210, 12 и 8 милливатт соответственно, кадры на видео на 300 и коэффициент усиления до 30 децибел. Отрегулируйте фокус до тех пор, пока относительно небольшие частицы не будут хорошо видны.

Увеличение масштаба и/или усиления может помочь с фокусировкой частиц. Но если вы увеличиваете коэффициент усиления, не забудьте установить его на 30 децибел перед записью. Как только частицы будут в фокусе, установите настройку масштабирования на 0,5X, чтобы сэкономить пропускную способность и предотвратить потерю кадров, и нажмите кнопку запись, чтобы начать запись видео.

Когда появится запрос о том, что видео были записаны, нажмите кнопку ОК, чтобы завершить запись, и выберите вкладку процесса. Если во время записи в любом видео были видны очень крупные частицы, перейдите в каталог записанных видео и удалите все проблемные видео перед обработкой. Установите флажок переопределить обнаружение звука и установите диаметр функции на 30.

Щелкните Процесс, чтобы начать обработку видео и просмотреть график распространения в реальном времени. После завершения обработки нажмите кнопку ОК и выберите вкладку графика. Для электромобилей отобразите основную диаграмму в виде логарифма кремнезема.

Другие функции графика, такие как изменение оси X для установки области для интеграции полученной фигуры, могут быть настроены. Чтобы создать ОТЧЕТ о результатах в формате PDF, нажмите кнопку отчета. Будут отображены среднее значение, медиана, размер режима и концентрация, скорректированные с учетом коэффициента разрежения и ширины распределения.

NTA разбойника следует выполнять перед любым образцом, чтобы концентрация этой заготовки могла быть вычтена из концентрации частиц образца EV. Чтобы очистить кюветы после анализа, опорожните кювету и полностью заполните кюветы 10-15 раз деионизированной водой и три раза 70-100% этанолом, чтобы удалить любой остаточный образец. Высушите внешнюю часть кювет безворсовой салфеткой из микрофибры и высушите внутреннюю часть с помощью пылесборника со сжатым воздухом.

Чтобы очистить вставки и перемешать батончики, поместите материалы в стеклянный сцинтилляционный флакон, содержащий от 70 до 100% этанола, и энергично встряхните флакон. Затем промойте вкладыши и перемешайте батончики в деионизированной воде с встряхиванием, как показано на продемонстрированной основе, и высушите их с помощью безворсовых тканей. После высыхания сразу же поместите все чистые компоненты в хранилище до следующего анализа.

Перед выполнением анализа калибровка прибора была проверена с использованием полистирольных шариков для обеспечения достоверности полученных данных. Как было замечено, инструмент отслеживания частиц точно сообщал о размере 100-нанометровых бусин манодисперсов, но только близко сообщал о размере 400-нанометровых бусин. Поэтому настройки прибора для этого протокола были более точными для более мелких частиц, размером ближе к 100 нанометрам.

Используя эти настройки, сообщали шкалы концентрации частиц соответственно коэффициенту разрежения, демонстрируя, что прибор может точно обнаруживать концентрацию частиц при различных разбавлениях с небольшой изменчивостью между техническими репликантами. Оптимальное разбавление для образца EV, полученного из ткани мыши, в 4,41 раза от 10 до 10-10-ти частиц на миллилитр мыши, было определено как от 1 000 до 3000. При этом анализе увеличение коэффициента усиления увеличивалось чувствительность камеры, позволяя увеличить визуализацию большего количества более мелких частиц.

Увеличение мощности синего лазера с 70 до 210 милливатт при сохранении постоянной мощности зеленого и красного лазера сместило зарегистрированный средний размер частиц со 122 до 105 нанометров и увеличило общую концентрацию частиц с 1,1 раза 10 до восьмой до 1,7 раза 10 до восьмой. Увеличение мощности красного лазера увеличило зарегистрированный средний размер частиц со 175 до 246 нанометров и уменьшило общую концентрацию частиц. Увеличение мощности зеленого лазера привело к уменьшению зарегистрированного среднего размера частиц и увеличению общей концентрации частиц.

Поиск правильного разбавления для размещения образца в пределах оптимального диапазона обнаружения может занять несколько попыток для каждого образца. Чистка кюветы также требует особого бережного обращения. Мы рекомендуем применять более одного ортогонального метода для измерения размера и концентрации частиц EV.

Динамическое рассеяние света, резистивное импульсное зондирование, просвечивающая электронная микроскопия и интерферометрическое измерение отражательной характеристики одной частицы также могут быть выполнены для характеристики электромобилей.